可比性研究|使用HR-MAM方法對(duì)原研藥與其生物類似藥進(jìn)行可比性研究

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可比性研究

生物類似藥通常指與參考分子（原研藥）高度類似的治療性生物產(chǎn)品1。世界各地的監(jiān)管機(jī)構(gòu)，如美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(United States Food and Drug Administration, USFDA), 歐洲藥品管理局（European Medicines Agency, EMA）和中國(guó)市場(chǎng)監(jiān)督管理總局（National Medical Products Administration, NMPA）均發(fā)布了指導(dǎo)規(guī)則，要求證實(shí)生物類似藥與原研藥之間在藥品安全性/功效性等方面的相似度1。

隨著高分辨質(zhì)譜（HRAM MS）逐步成為創(chuàng)新藥和生物類似藥表征*的分析工具，在氨基酸序列確認(rèn)和化學(xué)/翻譯后修飾等鑒定中，均起到*的作用2。2015年，Rogers 等2在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中提及可將基于肽圖分析的Multi-Attribute Method (MAM) 工作流程用于多重PQA的監(jiān)控與定量，與此同時(shí)還可進(jìn)行新組分檢測(cè)（new peak detection）2，進(jìn)而提供更多產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)信息，并提高生產(chǎn)率。由此，MAM在質(zhì)量控制（QC）實(shí)驗(yàn)室中替代傳統(tǒng)分析手段的潛力，引起越來越多生物制藥行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)越來越多的關(guān)注2 3。2019年，US FDA的Rogstad等在發(fā)表的文獻(xiàn)中提及可以考慮使用MAM替代一些常規(guī)的QC分析方法4。

圖1 賽默飛HR-MAM工作流程

（點(diǎn)擊查看大圖）

本期我們介紹賽默飛HR-MAM (圖 1)工作流程的新進(jìn)展：對(duì)未經(jīng)處理/不同強(qiáng)制降解條件下的生物類似藥與利妥昔原研藥進(jìn)行可比性研究，對(duì)多個(gè)選定PQA進(jìn)行有效的鑒定、相對(duì)定量和監(jiān)控，以減少分析實(shí)驗(yàn)所花費(fèi)的時(shí)間，并提高生產(chǎn)率。

多PQA選定

助力原研藥與生物類似藥結(jié)構(gòu)相似性確證：

PQA通常在藥物安全性與有效性方面起到重要作用，基于肽圖分析表征可以選擇適合的PQA，如：糖基化（glycosylation），脫酰胺化（deamidation），琥珀酰亞胺化（succinimide formation），異構(gòu)化（isomerization），氧化（oxidation），重鏈C-末端賴氨酸截?cái)啵–-terminal lysine truncation），N-末端焦谷氨酸環(huán)化（N-terminal pyroglutamate）。

所有被選中的PQA可在BioPharma Finder軟件中創(chuàng)建為一個(gè)包含該P(yáng)QA肽段保留時(shí)間/質(zhì)荷比/價(jià)態(tài)/所有電荷態(tài)等信息的工作簿，隨后此工作簿被導(dǎo)入至變色龍軟件中，用于后續(xù)的MAM數(shù)據(jù)分析。使用HR-MAM工作流程，即使是含量約0.1%的組分，也可通過高分辨質(zhì)譜平臺(tái)提供的數(shù)據(jù)獲得高重現(xiàn)性的定性與定量結(jié)果。在本文的研究中，選定了下列PQA來證實(shí)HR-MAM工作流程用于目標(biāo)肽段定量的能力，

進(jìn)而評(píng)估利妥昔原研藥與生物類似藥之間的結(jié)構(gòu)相似性：

重鏈 N55 脫酰胺化和琥珀酰亞胺化;

重鏈 N388和N393 脫酰胺化;

重鏈 N388和N394 琥珀酰亞胺化;

重鏈 M256 氧化;

重鏈 D284 異構(gòu)化;

重鏈N-糖基化;

重鏈C-末端賴氨酸截?cái)嗪洼p/重鏈N-末端焦谷氨酸環(huán)化。

PQA相對(duì)定量

兼具穩(wěn)健性與重現(xiàn)性，MAM展現(xiàn)*潛力：

由于C-末端賴氨酸截?cái)嗯cN-末端焦谷氨酸環(huán)化等末端修飾會(huì)影響單克隆抗體產(chǎn)品的電荷異質(zhì)性5，所以在結(jié)構(gòu)可比性研究中需要對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。以本文中涉及的PQA為例，利妥昔原研藥和兩個(gè)不同批次的生物類似藥，其重鏈C-末端賴氨酸截?cái)嗯c輕/重鏈N-末端焦谷氨酸環(huán)化的比率均在可比范圍內(nèi)（圖2）。值得注意的是，所有定量結(jié)果三針技術(shù)重復(fù)的變異系數(shù)（coefficients of variation, CVs）均小于2%，顯示了優(yōu)異的重現(xiàn)性。

圖2. 利妥昔原研藥/生物類似藥在未經(jīng)強(qiáng)制降解/強(qiáng)制降解條件下常見末端修飾相對(duì)定量結(jié)果。圖中每個(gè)條柱均代表三針技術(shù)重復(fù)的平均值，誤差線代表三針技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（下同）。（點(diǎn)擊查看大圖）

N-糖基化可能會(huì)影響單克隆抗體產(chǎn)品的免疫原性、藥效、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性（complement-dependent cytotoxicity, CDC）、血清清除率和藥代動(dòng)力學(xué)5。在生物類似藥的開發(fā)和生產(chǎn)過程中，為了確保產(chǎn)品的安全性和有效性，N-糖基化必須被密切監(jiān)控并嚴(yán)格控制。對(duì)于生物類似藥開發(fā)廠商而言，生物類似藥的糖基化異質(zhì)性分布必須與其原研藥具有可比性，以避免擴(kuò)大臨床試驗(yàn)的規(guī)模。

在本方案涉及的實(shí)驗(yàn)所用的原研藥和生物類似藥樣品中，總共鑒定到15種不同糖型，這些糖型的相對(duì)含量在不同樣品之間并沒有明顯區(qū)別（圖3）。與傳統(tǒng)N-糖鏈定量方法相比，未發(fā)生糖基化修飾的肽段相對(duì)含量也可在HR-MAM工作流程中同時(shí)被監(jiān)控，這是傳統(tǒng)方法無(wú)法做到的，展現(xiàn)了其獨(dú)到價(jià)值。對(duì)所有糖型的相對(duì)定量結(jié)果同樣顯示了優(yōu)異的重現(xiàn)性和靈敏度。例如，對(duì)于相對(duì)含量約0.3%的糖型A2S1G0F ，其技術(shù)重復(fù)之間的CV<5.5%。

圖3. 利妥昔原研藥/生物類似藥在未經(jīng)強(qiáng)制降解條件下重鏈EEQYNSTYR 15種糖型相對(duì)定量結(jié)果（三針平行技術(shù)重復(fù)）。（點(diǎn)擊查看大圖）

對(duì)于其他選定PQA，借助于賽默飛高分辨質(zhì)譜平臺(tái)的高靈敏度和高選擇性，結(jié)合Vanquish UHPLC系統(tǒng)和Accucore Vanquish C18 +色譜柱提供的高重現(xiàn)性分離，均可實(shí)現(xiàn)兼具穩(wěn)健性與重現(xiàn)性兼具的相對(duì)定量。

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參考文獻(xiàn)：

[1] US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. Guidance for Industry. April 2015. 

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[3] Rogstad, S., et al. Multi-Attribute Method for Quality Control of Therapeutic Proteins. Anal. Chem. 2019, 91, 14170−14177.

[4] US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. Guidance for Industry. April 2015. 

[5] Beck, A., et.al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products. Anal. Chem. 2013, 85, 715−736.

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