蛋白質(zhì)作為所有生命周期的直接參與者，是生命現(xiàn)象和生物規(guī)律 變化的標(biāo)志物，在生命科學(xué)的大環(huán)節(jié)中占據(jù)著舉足輕重的地位。 從蛋白質(zhì)的角度去描述生物的變化，業(yè)已成為研究生命科學(xué)的主 要手段。處于不同時(shí)期、不同條件下的功能性蛋白質(zhì)，其表現(xiàn) 形式及豐度水平千變?nèi)f化、生理功能模塊和介導(dǎo)信號(hào)通路紛繁復(fù) 雜，因此，深入研究蛋白質(zhì)乃至對(duì)生物標(biāo)志物監(jiān)測充滿著艱辛與 挑戰(zhàn)。與早期關(guān)注蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)過程不一樣，目前生物化學(xué)家越 來越重視功能性蛋白質(zhì)在表達(dá)量上的變化，蛋白豐度的變化更能 體現(xiàn)出生命變化的多樣性。生化實(shí)驗(yàn)室最根本的分析任務(wù)之一就是蛋白的定量分析，但以往 的抗體免疫化學(xué)法 (Western Blot) 表現(xiàn)出較差的特異性和較高的 測量誤差 (CV > 20 - 40%)。串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM/SRM) 定量方法，一直以來就是定量的黃金標(biāo)準(zhǔn)，在小分子定量上早已 成熟使用，隨著液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的提高，越來越多的生化實(shí)驗(yàn)室開始大量采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白（肽段）定量 流程。MRM 肽段定量方法的優(yōu)點(diǎn)很多，它利用蛋白專屬的肽段 序列完成定量分析，一次運(yùn)行可同時(shí)分析幾十到幾百種的蛋白， 具備高通量的定量分析能力。特別是 2012 年，領(lǐng)域的期刊《Nature Methods》將基于三重四極桿質(zhì)譜 平臺(tái)的 MRM/SRM 定量思路的靶向蛋白質(zhì)組學(xué) (Targeted proteomics) 技術(shù)列為當(dāng)年的年度方法，確立了目標(biāo)蛋白定量分析的策略。近年來該雜志陸續(xù)發(fā)表了多篇論文，對(duì) 三重四級(jí)桿-MRM/SRM 思 路成功應(yīng)用于目標(biāo)蛋白定量分析進(jìn)行了持續(xù)報(bào)道。隨著質(zhì)譜靈敏 度的大幅提高，以大流速常規(guī)液相色譜 (LC) 取代納流液相色譜 (Nano-LC) 所組成的 MRM 肽段定量方法，代表著蛋白定量分析 的最高技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)生物化學(xué)及各種新應(yīng)用快速向前發(fā) 展，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)、生物制藥等研究領(lǐng)域，并迅速朝著 諸如食品、環(huán)境、臨床等更寬的應(yīng)用范圍發(fā)展。

MRM 方法作為一種成熟的定量技術(shù)，已經(jīng)廣泛用于食品安全檢 測和制藥行業(yè)以及肽段的檢測。以制藥為例，MRM 方法被用來 監(jiān)測血樣中藥物濃度或藥物代謝產(chǎn)物隨時(shí)間的變化?；谫|(zhì)譜 技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)常用的一種分析策略是采用特異性蛋白酶將蛋 白質(zhì)酶切形成肽段，生成的肽段經(jīng)過液相色譜分離后進(jìn)入質(zhì)譜分 析，通過鑒定蛋白對(duì)應(yīng)的唯yi性肽段 (Unique Peptides) 來鑒定 相應(yīng)的蛋白，該方法被稱為niao槍法 (Shotgun)，是蛋白質(zhì)組學(xué)經(jīng) 典的非靶向方法。該方法被廣泛用于復(fù)雜生物樣本，如血漿、細(xì) 胞、組織中蛋白的大規(guī)模鑒定，采用標(biāo)記或非標(biāo)記的方式通過相 對(duì)定量比較對(duì)照組和樣品組的差異可以發(fā)現(xiàn)具有診斷、預(yù)警或治 療有意義的潛在蛋白質(zhì)，即生物標(biāo)記物。僅以癌癥為例，目前文 獻(xiàn)報(bào)道的潛在生物標(biāo)記物就超過 1261 個(gè)[1]。然而，這其中幾乎 沒有一個(gè)潛在生物標(biāo)記物能滿足臨床生物標(biāo)記物的高標(biāo)準(zhǔn)而被認(rèn) 可，這一點(diǎn)從美國 FDA 批準(zhǔn)蛋白類生物標(biāo)記物的進(jìn)度就能證實(shí)。 過去 15 年，美國 FDA 批準(zhǔn)的針對(duì)所有疾病的生物標(biāo)記物平均下 來每年不超過 1.5 個(gè)蛋白[2]。在臨床上，目前使用的生物標(biāo)記物 的體內(nèi)濃度低、動(dòng)態(tài)范圍寬，濃度分布能跨越 11 個(gè)數(shù)量級(jí)；在分 析方法上又缺少一種能對(duì)大量不同樣品進(jìn)行精準(zhǔn)定量的高通量分 析方法。而 MRM 方法能彌補(bǔ)niao槍法的不足，提供了一種高靈敏 度、高精確度、高重現(xiàn)性和高通量的分析方法，非常適用于生物 標(biāo)記物的驗(yàn)證及系統(tǒng)生物學(xué)研究[3]。

MRM 方法充分發(fā)揮了 三重四級(jí)桿定量的優(yōu)勢。在 MRM 方法中，通 過采用 Q1 和 Q3 分別選擇目標(biāo)肽段的母離子和子離子來實(shí)現(xiàn)對(duì) 應(yīng)目標(biāo)蛋白的精確定量。兩級(jí)四極桿篩選為 MRM 方法提供了極 高的選擇性，降低了復(fù)雜樣品中共流出物的背景干擾[4]。同時(shí)， 三重四級(jí)桿方法采用選擇離子通過模式，相比于niao槍法的傳統(tǒng)全掃描模 式，方法的靈敏度提高了 1 - 2 個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，MRM 具有五 個(gè)數(shù)量級(jí)的線性動(dòng)態(tài)范圍，能夠檢測復(fù)雜樣品中的低豐度蛋白， 這在系統(tǒng)生物學(xué)定量研究中至關(guān)重要。MRM 檢測肽段方法建 立后，在不同的實(shí)驗(yàn)室里重復(fù)實(shí)驗(yàn)具有非常好的重現(xiàn)性；一個(gè)方 法內(nèi)可包含上千個(gè) MRM 離子對(duì)，能實(shí)現(xiàn)高通量的檢測[5]。通過 加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段 (Stable Isotope-labeled internal standards, SIS)，可以大大降低離子抑制、基質(zhì)效應(yīng)和樣品前處 理過程的誤差造成的影響，得到更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。對(duì)于一組給 定的待測蛋白質(zhì)，如信號(hào)通路上蛋白質(zhì)、一組生物標(biāo)記物，MRM 方法能夠進(jìn)行一致的、可重復(fù)的、高通量的精準(zhǔn)定量分析[6]。相 比于親和方法，MRM 不受到抗體種類及特異性的限制，能夠很 方便的進(jìn)行大規(guī)模研究。 目前靶向肽段定量的蛋白測定法，可以開展大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué) 定量分析項(xiàng)目，以及在大規(guī)模地開發(fā)、系統(tǒng)性地驗(yàn)證蛋白質(zhì)生物 標(biāo)志物；加之快速成熟的分析方法和軟件，以及廣泛接受和普遍 使用的質(zhì)譜儀器，為生物化學(xué)家提供了系統(tǒng)、可靠、革命性的蛋 白定量平臺(tái)，促進(jìn)了系統(tǒng)生物學(xué)、臨床研究、生物制藥及 其它相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域的高速發(fā)展。

 MRM 肽段定量的完整流程包含如下 6 個(gè)模塊：① 獲取靶 蛋白序列，② 選擇特異序列肽段（Skyline 軟件），③ 構(gòu)建 MRM 離子對(duì)及參數(shù)優(yōu)化（Skyline 軟件或安捷倫 optimizer 軟件），④ 樣品處理及制備，⑤三重四級(jí)桿數(shù)據(jù)采集及 ⑥ 分析結(jié)果（安捷倫 MassHunter 定量軟件或 Skyline 軟件）。 簡單介紹一下這六大模塊。首先，① 從實(shí)驗(yàn)或科學(xué)文獻(xiàn)著手獲得 已知蛋白的序列表，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)就是要選擇出靶蛋白的典型肽 段。MRM 最希望檢測的是穩(wěn)定的肽段，所以為了減少可能的誤 差，要盡量避免用容易發(fā)生人為修飾的殘基肽段，比如：蛋氨酸 （易發(fā)生氧化反應(yīng)）和半胱氨酸（易發(fā)生脲甲基化和氧化反應(yīng)） 等。② 選出來的肽段序列應(yīng)該是唯yi對(duì)應(yīng)其蛋白質(zhì)，越能提高 檢測的特異性，就越能減少對(duì)結(jié)果干擾，由于生物樣本的復(fù)雜 性，每一個(gè)肽段往往需要選擇三個(gè)離子對(duì)（母離子-子離子）所產(chǎn)生的信號(hào)。利用 Skyline 軟件可以便捷地從特異性的肽段構(gòu)建 MRM 離子對(duì)做定量分析。③ 配適 Agilent 1290 Infinity II 液 相色譜/6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) (1290 LC/6495 三重四級(jí)桿) 的 Skyline 專業(yè)軟件可以智能優(yōu)化肽段的保留時(shí)間、碰撞能量，并采 集出優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果供科學(xué)家審核，最終自動(dòng)生成分析實(shí)際樣 品的實(shí)驗(yàn)方法。④ 蛋白定量的實(shí)驗(yàn)要求苛刻，且基質(zhì)復(fù)雜肽段 碎片眾繁，因此蛋白樣品制備就成為能否成功的關(guān)鍵一步，安捷 倫 AssayMAP 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品精準(zhǔn)、高通量而且可靠耐用的自動(dòng) 處理。⑤ 樣品通過液相的分離和串聯(lián)質(zhì)譜的 MRM 測量，⑥ 最 終結(jié)果可利用 MassHunter 定量軟件或 Skyline 軟件分析并計(jì)算 蛋白豐度。從六大模塊流程中可以看出，安捷倫肽段定量流程的 設(shè)計(jì)理念和軟件支持有*之處，其流程特點(diǎn)及技術(shù)優(yōu)勢在下文 詳述。

基于 三重四級(jí)桿 平臺(tái)的 MRM 肽段定量方法靈敏、精確，同時(shí)具有高 重現(xiàn)性和高通量。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)不斷發(fā)展，在實(shí)驗(yàn)室的純理論 研究已經(jīng)不斷向各個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域滲透，越來越廣泛地應(yīng)用于以蛋白 質(zhì)研究為基礎(chǔ)的多種新興應(yīng)用分析領(lǐng)域，諸如：生物藥物的臨床 使用、抗體藥物偶聯(lián)物 (ADC) 的研究、蛋白藥物的毒性預(yù)測等； 甚至是原來的傳統(tǒng)小分子分析領(lǐng)域，像食品安全分析（蛋白質(zhì)鑒 別，過敏原分析等）、臨床疾病診斷（發(fā)現(xiàn)并鑒定大量功能蛋白 質(zhì)和潛在疾病蛋白質(zhì)標(biāo)志物）、環(huán)境保護(hù)（生物毒素監(jiān)測，暴露 組學(xué)等）、能源化工（生物燃料質(zhì)量控制），也都出現(xiàn)了對(duì)生物大分子豐度測定的需要。安捷倫在 AssayMAP 樣品自動(dòng)化前處理 和 三重四級(jí)桿平臺(tái)基礎(chǔ)之上，巧妙借助生物肽段序列的質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)庫 和數(shù)據(jù)分析設(shè)計(jì)軟件，開發(fā)出了系統(tǒng)性的 MRM 肽段定量方法， 從而可以高靈敏、高精密度和高效地定量分析蛋白質(zhì)以及其衍生 出的肽段生物分子，獲得這些蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度，為蛋白質(zhì)差異 分析提供了更可靠、動(dòng)態(tài)范圍更廣的技術(shù)手段，方便生命科學(xué)家 深入了解細(xì)胞、組織或生物體的整體蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)，為人類健康 的福祉服務(wù)。