【概述】

雌激素是由卵巢分泌的一類類固醇激素，其通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后會(huì)擾亂體內(nèi)激素平衡，影響生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)乳腺癌、卵巢癌等疾病[1-2]。

1996年歐盟明令禁止使用具有促生長(zhǎng)作用的激素（Council Directive 96/22/EC, 96/23/EC）?！吨腥A人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)》也規(guī)定了雌激素為禁用藥物。但是食品中微量雌激素殘留問(wèn)題依然存在，為了有效地監(jiān)督動(dòng)物源性食品的質(zhì)量，開(kāi)發(fā)具有高靈敏、高通量檢測(cè)雌激素殘留的確證分析方法是非常必要的。

目前，關(guān)于動(dòng)物源性食品中雌激素殘留的測(cè)定方法已有綜述報(bào)道［3-4］，主要有液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）和氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）。但是，關(guān)于牛奶和奶粉中雌激素的文獻(xiàn)報(bào)道較少［5-8］。奶及奶制品基質(zhì)成分復(fù)雜，激素殘留量低，而且部分激素化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，影響分析準(zhǔn)確性，因此需要建立快速、準(zhǔn)確的方法來(lái)解決奶及奶制品中的雌激素檢測(cè)問(wèn)題。本工作旨在建立一種GC-MS法快速、靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定奶及奶制品中炔雌醇、17β－雌二醇和雌三醇的殘留量。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；

柱溫：60℃（1 min），

          20℃/min到200℃（3 min），

          20℃/min到260℃（5 min），

          20℃/min到280℃（10 min）；

進(jìn)樣模式：大體積進(jìn)樣；進(jìn)樣量：5 µL；

進(jìn)樣口溫度：50℃（0.05 min），

                    14.5℃/sec到80℃（1 min）（分流出口流量20mL/min），

                    14.5℃/sec到260℃（15 min）；

載氣：氦氣（99.999%），恒流模式，1 mL/min；

質(zhì)譜離子源溫度：300℃，傳輸線溫度：300℃；

掃描模式：選擇離子監(jiān)測(cè)模式，17β－雌二醇：

285,286,416*,417；炔雌醇：285,300,425*,440；

雌三醇：311,345,386,504*

【樣品提取】

提取

A）液態(tài)樣品準(zhǔn)確稱取10g牛奶樣品，于50mL離心管中，加乙腈5mL、乙酸乙酯15mL，漩渦振蕩3min，10000r/min離心10min，收集上清液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1mol/L氫氧化鈉溶液6mL分三次溶解，轉(zhuǎn)至另一50mL離心管中，加正己烷20mL漩渦振蕩1min，10000r/min離心10min，收集下層提取液，用5mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至5.0-5.2，備用。

B）固態(tài)樣品準(zhǔn)確稱取2.0g奶粉樣品，于50mL離心管中，加乙酸乙酯15mL，漩渦振蕩3min，10000r/min離10min，收集上清液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1mol/L氫氧化鈉溶液6mL分三次溶解，轉(zhuǎn)至另一50mL離心管中，加正己烷20mL漩渦振蕩1min，10000r/min離心10min，收集下層提取液，用5mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至5.0-5.2，備用。

凈化

   C18柱依次用甲醇5mL和水5mL活化，取備用液過(guò)柱，用水5mL淋洗，抽干，用甲醇5mL洗脫，收集洗脫液，加正己烷1mL，振蕩，棄去正己烷層，重復(fù)兩次，甲醇層于40℃水浴氮?dú)獯蹈伞?/p>

衍生

  殘余物加吡啶和衍生化試劑各100µL溶解，混勻，封口，殘余物加吡啶和衍生化試劑各100µL溶解，混勻，封口，過(guò)0.22µm濾膜，供氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定。

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

本方法是將樣品中的雌激素用乙酸乙酯提取，固相萃取的方法凈化，衍生后用氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行定性、定量。該方法定量準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能夠滿足目前奶及奶制品中雌激素檢測(cè)的需要。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

衍生條件的優(yōu)化

乙酸乙酯、甲苯和正己烷等有機(jī)溶劑在衍生反應(yīng)的過(guò)程中，都能部分地轉(zhuǎn)化炔雌醇的衍生物為雌酮的衍生物，從而造成對(duì)樣品結(jié)果的錯(cuò)誤估計(jì)。吡啶是較合適的反應(yīng)介質(zhì)，不會(huì)有衍生產(chǎn)物之間的相互轉(zhuǎn)化。

儀器分析方法優(yōu)化

以全掃描的方式對(duì)3種雌激素的衍生產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，得到其質(zhì)譜圖（圖1）。根據(jù)全掃描質(zhì)譜圖和保留時(shí)間，選擇合適的定性和定量的特征目標(biāo)監(jiān)測(cè)離子。測(cè)定時(shí)，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物和待測(cè)物的定量離子流圖中的峰面積，外標(biāo)法定量。確證時(shí)，可根據(jù)碎片離子及其豐度比作為其陽(yáng)性判別的依據(jù)。在選定的色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1.雌二醇、炔雌醇、雌三醇（自上而下）的質(zhì)譜圖

圖2. 200ng/mL雌激素標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生產(chǎn)物色譜圖

線性關(guān)系及測(cè)定低限

準(zhǔn)確移取適量雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別用甲醇稀釋配制得到濃度為5、10、20、50、100、200ng/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，各取1mL氮?dú)獯蹈?，加入衍生試劑和吡啶，按上述方法進(jìn)行衍生，供氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定。以測(cè)定峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。方法檢出限以3倍信噪比計(jì)算得到，本方法牛奶的測(cè)定低限為0.5µg/kg，奶粉的測(cè)定低限為2.0µg/kg。

圖3.三種雌激素的線性情況

回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶和奶粉樣品中，添加雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按上述方法進(jìn)行提取、凈化、衍生和測(cè)定，牛奶樣品添加濃度為1µg/kg和2µg/kg兩個(gè)水平，奶粉樣品添加水平為10µg/kg，各做3個(gè)平行，空白樣品、添加譜圖見(jiàn)圖4，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4.樣品空白和樣品加標(biāo)譜圖（自上而下依次為空白樣品、樣品加標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液）

表1.空白樣品添加實(shí)驗(yàn)回收率和精密度

結(jié)論

樣品中的雌激素經(jīng)乙酸乙酯提取后，經(jīng)C18固相萃取小柱凈化，衍生后采用賽默飛世爾新型的氣相色譜質(zhì)譜儀檢測(cè)和確證，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，三種雌激素的平均回收率為61.7-84.6%，3次平行測(cè)定的RSD值≤14.1%，方法測(cè)定低限為0.5ng/g。此法靈敏度高，能夠滿足牛奶和奶粉中雌激素的殘留分析要求。

【儀器/耗材清單】

儀器

Trace1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配EI源（ThermoScientific）；AS1310自動(dòng)進(jìn)樣器（Thermo Scientific）

恒溫干燥箱、離心機(jī)、天平、漩渦混合器、氮吹儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、固相萃取儀（Thermo Scientific）

耗材

色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）（Thermo Scientific,PN: 26098-1420）

C18 SPE柱，500mg，3mL（Thermo Scientific）

試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

炔雌醇、17β－雌二醇和雌三醇標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥99%；

氫氧化鈉：優(yōu)級(jí)純；鹽酸：優(yōu)級(jí)純；無(wú)水硫酸鈉：優(yōu)級(jí)純；

正己烷、乙酸乙酯、乙腈、吡啶：

衍生試劑：BSTFA+TMCS(99+1)