引言：全球范圍內(nèi)的藥品消耗量很高，而且由于醫(yī)療衛(wèi)生條件的改進(jìn)和平均壽命的延長，這個(gè)數(shù)量將持續(xù)增加。大量的藥物及其代謝物被人類排出體外，進(jìn)入污水處理廠，這些物質(zhì)在污水處理廠未被*處理掉而最終留在了環(huán)境中。這些藥物殘留會(huì)對(duì)水陸生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。美國地質(zhì)調(diào)查局（USGS）最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn) 80% 的溪流水樣中存在化學(xué)污染物，而類固醇是最常檢測到的一類化合物。這些類固醇在很低的濃度就能引起生物學(xué)反應(yīng)，包括雄性魚的雌性化。加拿大一項(xiàng)延續(xù)七年的全湖實(shí)驗(yàn)表明，某魚種持續(xù)接觸類固醇17a-炔雌醇中會(huì)導(dǎo)致湖中該魚種幾乎滅絕 [1]。這些類固醇也有可能進(jìn)入食物鏈以及飲用水中。歐盟水框架指令（2000/60/EC）[2] 提倡合理利用水資源，包括長期減少廢水污染物如類固醇排放到水環(huán)境中。指令的實(shí)施需要一個(gè)靈敏、準(zhǔn)確且可靠的檢測方法來支撐。本文介紹了 2000/60/EC 指令中化學(xué)研究項(xiàng)目的部分內(nèi)容，即采用配置 iFunnel 技術(shù)的 Agilent 6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)類固醇的高靈敏度檢測方法進(jìn)行優(yōu)化。該儀器可獲得比以往儀器更低的檢測限，從而使得在傳統(tǒng)流速下就可以獲得介摩級(jí)（zeptomole）的靈敏度，這使它成為重點(diǎn)藥物分析應(yīng)用的理想選擇，如環(huán)境中類固醇的檢測。

雖然早先的質(zhì)譜儀器已經(jīng)開發(fā)了類固醇檢測和定量分析的液質(zhì)聯(lián)用的方法，但是，為了獲得最高的靈敏度還必須在 6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)上對(duì)已有的方法進(jìn)行優(yōu)化。使用優(yōu)化的參數(shù)檢測廢水中幾種類固醇化合物，可以實(shí)現(xiàn)廢水中低于 1 ng/L（萬億分之一）的檢測限。

實(shí)驗(yàn)部分試劑和標(biāo)準(zhǔn)品乙酸乙酯、乙腈、異丙醇、環(huán)己烷和甲醇均為 HPLC 級(jí)或 glassdistilled 級(jí)。鹽酸（37%）和氨水（30%）均為分析純。硝酸銅是通用級(jí)別試劑或者更高純度。水為 HPLC 級(jí)或者 Elga 高純水。聚苯乙烯二乙烯苯固相萃取（SPE）小柱（200 mg）購自 Baker公司。GF/D 玻璃微纖維濾紙購自 Whatman 公司（Kent，UK）。雌酮、雌二醇和炔雌醇的乙腈溶液（濃度均為 100 mg/L）購自QMX Laboratories 有限公司（Thaxted，UK）。取一定量的上述三種溶液分別加入到甲醇中制成濃度為 1.0 mg/L 的校正標(biāo)。用甲醇/水（10:90）稀釋成濃度為 1、2、5 和 10 µg/L 的校正混標(biāo)。這些混標(biāo)中還包含 2 µg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液。作為內(nèi)標(biāo)的氘代雌酮-D4、雌二醇-D5 和炔雌醇-D4 購自 QMX 實(shí)驗(yàn)室。各內(nèi)標(biāo)物先分別制成 100 mg/L 的乙腈溶液，再用甲醇稀釋 制 成 1.0 mg/L 的 內(nèi) 標(biāo) 混 合 溶 液 ， 并 進(jìn) 一 步稀釋 成0.1 mg/L 的甲醇溶液。

儀器通過配備 100 µL 定量環(huán)的 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)與采用 iFunnel 技術(shù)的 6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)方法 優(yōu)化和廢水分析。通過連接于色譜柱和霧化器之間的三通閥上的另一個(gè)外部泵來實(shí)現(xiàn)柱后加入 0.1% 的氨水溶液。儀器條件見表 1。樣品采集、制備和凈化用 2 L 的棕色玻璃瓶采集樣品，同時(shí)加入 2 mL 濃鹽酸和 0.5 g 硝酸銅，并于 10 °C 以下儲(chǔ)存。對(duì)此保存條件下樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行14 天連續(xù)考察。樣品提取后，提取物分析前在防爆冰箱中至少可保存 4 周。每個(gè)樣品在萃取之前都要用 GF/D 濾紙過濾。1 L 樣品中加入20 µL 內(nèi)標(biāo)混合溶液。100 mL 未經(jīng)處理的污水樣品中加入 900 mL水和 20 µL 內(nèi)標(biāo)混合溶液。樣品采用已依次用乙酸乙酯（5 mL）、甲醇（5 mL）和水（3 mL）活化過的 SPE 小柱進(jìn)行萃取。萃取柱上加樣 250 mL，并依次用 3 mL 60% 甲醇和 3 mL 水進(jìn)行淋洗。萃取柱真空干燥 40 min 后，用 4 mL 的乙酸乙酯洗脫。樣品瓶置于 45 °C 的加熱塊上，洗脫液隨著空氣流蒸發(fā)，最后殘?jiān)?50 µL 的環(huán)己烷/異丙醇（95:5）復(fù)溶。萃取物用正相色譜法進(jìn)行純化，收集保留時(shí)間 5.8-8.6 min 的洗脫液。色譜條件如下：儀器：Agilent 1100 系列液相色譜儀；色譜柱：安捷倫 ZORBAX Cyano 色譜柱（部件號(hào) 883952-705），4.6x 150 mm，5 µm；柱溫：55 °C；等度分離；流動(dòng)相：環(huán)己烷/異丙醇（95 : 5）；流速：1 mL/min。樣品瓶置于 45 °C 的加熱塊上，洗脫液隨著空氣流蒸發(fā)，殘?jiān)?250 µL 的甲醇/水（90 : 10）復(fù)溶。最后得到終體積為 250 µL 的溶液，濃度相當(dāng)于起始濃度的1000 倍。因此，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于原始濃度為 1、2、5 和10 ng/L。

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結(jié)果與討論分析參數(shù)的優(yōu)化雖然已經(jīng)有用老型號(hào)的儀器分析類固醇的方法，但是為了充分利用采用 iFunnel 技術(shù)的安捷倫 6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)靈敏度，這些方法參數(shù)必須進(jìn)行優(yōu)化。為此以在 6460 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)上開發(fā)的方法作為基礎(chǔ)進(jìn)行參數(shù)的優(yōu)化。碰撞池加速電壓（CAV）是優(yōu)化產(chǎn)物、檢測和離子定量的關(guān)鍵參數(shù)。圖 1 表明當(dāng)加速電壓由 5 V 變?yōu)?2 V 時(shí)，配制成標(biāo)準(zhǔn)校正溶液的 3 種類固醇物質(zhì)的響應(yīng)值顯著增加。

倍增管電壓（即 EMV 增益）是顯著影響響應(yīng)值的另一個(gè)參數(shù)。以100 V 的步長從 100 V 遞增到 400 V，整個(gè)范圍內(nèi)的響應(yīng)值增加了14 倍。當(dāng)倍增管電壓超過 400 V 時(shí)，響應(yīng)值仍會(huì)繼續(xù)增加，但信噪比保持不變甚至降低。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最佳的電壓值約為 200-300 V（圖 2）。