摘要：清潔驗(yàn)證 (CV) 是藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范 (GMP) 對原料藥和藥品生產(chǎn)的要求。大多數(shù)藥物的清潔驗(yàn)證研究通常選用配備紫外檢測器的液相色譜儀，其靈敏度水平約為 20-50 ng/mL。對于高效藥物，應(yīng)用配備擴(kuò)展光程流通池的紫外檢測或質(zhì)譜檢測可實(shí)現(xiàn)靈敏度水平低至 ng/mL 的清潔驗(yàn)證方法。在 Agilent 6150 系列單四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)上使用安捷倫噴射流離子源的UHPLC/MS 方法具有更高的靈敏度，其顯示出更低（約 0.5 ng/mL）的定量限 (LOQ)。此外，采用更高的進(jìn)樣量可進(jìn)一步降低 LOQ。本研究介紹了對濃度范圍為 0.5 ng/mL 至 1000 ng/mL 的五種模型藥物的 2 分鐘通用清潔驗(yàn)證方法。該通用清潔驗(yàn)證檢測方法通常可適用于許多不同的藥物，只需極少的方法開發(fā)、認(rèn)證和轉(zhuǎn)換工作。本應(yīng)用簡報(bào)還介紹了采用用戶補(bǔ)充的 NIST 質(zhì)譜庫搜索程序鑒定未知化合物。

前言必須進(jìn)行清潔驗(yàn)證 (CV) 以證明生產(chǎn)鏈（容器和加工設(shè)備）的清潔度，確認(rèn)活性藥物成分 (API) 已被充分去除，達(dá)到預(yù)先確定的可接受限值。開發(fā)針對高效藥物（SafeBridge 類別 3B 或 41）或具有弱發(fā)色團(tuán)的藥物的高靈敏度CV 方法挑戰(zhàn)性。對于高效藥物而言，可接受標(biāo)準(zhǔn)通常要求檢測限低至 ng/mL 級。利用長光程 UV 流通池或質(zhì)譜檢測器能夠提高傳統(tǒng) LC-UV 方法的靈敏度2。此外，偶爾觀察到未知化合物，應(yīng)當(dāng)在 CV 研究中進(jìn)行鑒定。本研究的目的是展示一種快速、靈敏、通用的 UHPLC/UV/MS 方法，用于對高效藥物進(jìn)行清潔驗(yàn)證，并建立一種更簡單的鑒定未知化合物的方法。配備 UV 最大光強(qiáng)流通池的 Agilent 1290Infinity 液相色譜系統(tǒng)由于光程擴(kuò)展而表現(xiàn)出更高的信號強(qiáng)度。在早期研究中，使用傳統(tǒng) HPLC 色譜柱所進(jìn)行的清潔驗(yàn)證研究表明，60 mm 最大光強(qiáng)流通池的靈敏度相比于標(biāo)準(zhǔn) 10 mm 流通池提高了約 2-5 倍3,4。在此研究中我們證實(shí)了采用更快速的 UHPLC 方法獲得了相似的結(jié)果。

Agilent 6150 系列單四極桿質(zhì)譜儀也同樣適用于高靈敏度 CV 檢測。安捷倫噴射流離子源 (AJS) 通過使用熱鞘氣將噴霧集中防止離子源中的進(jìn)一步柱外電噴霧譜帶展寬，與標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源 (ESI) 相比，靈敏度提高多達(dá) 10 倍。AJS 離子源還適用于更寬的流速范圍(20–2000 µL/min)。CV 方法所用的高流速可縮短分析時(shí)間，且不影響峰容量。AJS 離子源相比于常規(guī) ESI 源，還能夠使不同類別的化合物實(shí)現(xiàn)更有效的離子化。單一通用的 UHPLC/UV/MSCV 方法提高了中試規(guī)?；蛑圃旃S的實(shí)驗(yàn)室工作效率5，對快速樣品周轉(zhuǎn)提出了更高的要求。在 CV 樣品中，可能存在不同的殘留化合物，例如來自當(dāng)前或之前批次的 API、副產(chǎn)物、降解物、賦形劑或清潔劑。借助用戶創(chuàng)建的質(zhì)譜庫，LC/UV/MS 檢測還可鑒定色譜圖中的未知峰。Agilent OpenLab ChemStation有利于在 NIST 質(zhì)譜庫搜索程序中創(chuàng)建附加的自定義譜庫。本應(yīng)用簡報(bào)記錄了使用 Agilent PoroshellC18 色譜柱 (3.0 × 30 mm, 2.7 µm) 針對五種常見藥物開發(fā)的通用高通量UHPLC/UV/MS 方法。相比于那些全多孔顆粒填料色譜柱，這種以表面多孔顆粒填料填充的快速液相色譜柱可改善動力學(xué)性能，并且能夠在 1 mL/min流速下運(yùn)行 2 分鐘。使用該程序，采用 UV 和 MS 相結(jié)合的方法能夠?qū)舛确秶鸀?0.5 ng/mL 至 1000 ng/mL 的五種模型藥物的混合物進(jìn)行測量。對此方法的方法性能（例如特異性、精密度、準(zhǔn)確度、檢測限 (LOD)、定量限(LOQ) 和線性）進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠滿足預(yù)期用途要求。還展示了自定義質(zhì)譜庫的創(chuàng)建及其搜索功能。該方法可能適用于各種藥物的 CV，且所需的方法開發(fā)、認(rèn)證和轉(zhuǎn)換工作極少。

實(shí)驗(yàn)部分開發(fā)出一種通用的 LC-UV/MS 方法并應(yīng)用于五種模型藥物：磺胺甲二唑、磺胺甲惡唑、心得安、丙咪嗪。盡管這些藥物并不具有很高的藥效，但是選擇它們足以說明方法性能和系統(tǒng)功能。本文還展示了采用標(biāo)準(zhǔn)流通池和擴(kuò)展光程 UV 流通池以及 MS-SIM/SCAN 模式對上述藥物進(jìn)行分析所獲得的各種濃度下的線性。本研究還使用大體積進(jìn)樣對磺胺甲惡唑的信噪比 (S/N) 的改善程度進(jìn)行了探究。表 1 顯示了所開發(fā)的通用方法的儀器參數(shù)詳情。

試劑與材料使用的所有溶劑和添加劑均為 LC/MS級，購自 Sigma-Aldrich (Saint Louis,MO, USA)。純水來自 Millipore 公司的Millipore Milli-Q 水純化系統(tǒng) (Billerica,MA, USA)。標(biāo)樣的前處理在甲醇中配制濃度為 1000 µg/mL的磺胺甲二唑、磺胺甲惡唑、心得安、丙咪嗪儲備液。使用50:50 [甲醇:流動相 A (MPA)] 將儲備液稀釋為 10 µg/mL 的工作溶液。通過連續(xù)稀釋配制各種濃度的線性溶液。濃度 (ng/mL) 分別為：0.2、0.3、0.5、1、5、10、20、30、50、100、500、1000、2000、5000 和 10000。

‍

結(jié)果與討論UHPLC/UV 檢測在該通用 UHPLC/UV 方法中使用配備高靈敏度最大光強(qiáng) 60 mm 流通池或標(biāo)準(zhǔn) 10 mm 流通池的 Agilent 1290 Infinity二極管陣列檢測器（表 1）。在使用10 mm 流通池的情況下，將五種化合物的混合物重復(fù)進(jìn)樣六次所獲得的色譜圖進(jìn)行疊加（圖 1）。使用兩種流通池進(jìn)行濃度最高為 10000 ng/mL 的線性實(shí)驗(yàn)。就磺胺甲二唑而言，使用高靈敏度流通池和標(biāo)準(zhǔn)流通池分別得到5 ng/mL 和 20 ng/mL 的 LOQ。正如預(yù)料，采用高靈敏度流通池得到的檢測限比采用 10 mm 流通池得到的檢測限低 3-4 倍。這些結(jié)果與早期研究相差無幾2。采用兩種流通池得到的 LOD/LOQ 濃度范圍如表 2 所示。使用 UV 檢測器和標(biāo)準(zhǔn)流通池可獲得 20-50 ng/mL的 LOQ。在該線性范圍研究中，處于實(shí)驗(yàn)濃度水平的化合物的線性表明相關(guān)系數(shù) R2 > 0.99（圖 2）。

發(fā)現(xiàn) LOQ 下的峰面積和保留時(shí)間的RSD 分別小于 5% 和 0.1%（表 3）。實(shí)驗(yàn)濃度下所有化合物的線性均表現(xiàn)出線性相關(guān)系數(shù)或 R2 > 0.98（圖 4）。采用 1/x 的加權(quán)因子2 由線性方程推算出的準(zhǔn)確度值處于 15% 以內(nèi)（表 4）。還將單離子監(jiān)測 (SIM) 方法所獲得的LOQ 同 MS 掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，其中 SIM 和全掃描數(shù)據(jù)在同一次運(yùn)行中進(jìn)行采集。來自全掃描數(shù)據(jù)的化合物提取離子色譜圖 (EIC) 的 LOQ 對于所有化合物均為 5 ng/mL（數(shù)據(jù)未示出），表明 SIM 模式的靈敏度比全掃描模式高大約 10 倍。用于 LC/MS 運(yùn)行的大體積進(jìn)樣研究了在高靈敏度 CV 方法中使用大體積進(jìn)樣獲得更低 LOQ 的可能性。這對于需要更高靈敏度的情況十分有用。大體積進(jìn)樣可提高峰面積和 S/N，但是可能增加譜峰展寬。這可能并非 CV測定中主要關(guān)心的問題，因?yàn)樵趯?shí)際CV 樣品溶液中很少觀察到與多種 API相關(guān)的峰。使用該通用方法獲得的三種不同濃度的磺胺甲惡唑的大體積進(jìn)樣結(jié)果如表 5 所示。結(jié)果表明，在30 mm 色譜柱上，當(dāng)進(jìn)樣量由 5 µL 增加至 12 µL 時(shí)，峰面積、峰寬和 S/N分別提高了 57%、31% 和 41%。磺胺甲惡唑研究表明，采用更高體積的進(jìn)樣 (10 µL) 能夠使靈敏度再提高 2 倍。在本研究所用的 3 mm 色譜柱上，采用 12 µL 以上的大體積進(jìn)樣將導(dǎo)致譜峰分裂。

‍

結(jié)論高效藥物的 CV 需要采用高靈敏度和高通量方法。本研究開發(fā)出了一種用于 CV 的 2 分鐘通用方法，并采用五種常見藥物對其進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果展示了該方法在此應(yīng)用中的性能。使用UV 和 MS (SIM) 檢測分別可獲得 20-50 ng/mL 和 0.5 ng/mL 的 LOQ。使用最大光強(qiáng) UV 流通池和大體積進(jìn)樣可進(jìn)一步改善該方法，其靈敏度可分別提高 2-4 倍和 2 倍（使用 10 µL 的進(jìn)樣量）。Agilent 1290 Infinity UHPLC與配備安捷倫噴射流離子源 (AJS) 的Agilent 6150 單四極桿質(zhì)譜儀在 SIM 或SCAN 模式下運(yùn)行，為 CV 研究提供了一種通用的工具，適用于對來自生產(chǎn)設(shè)備的沖洗溶液進(jìn)行定量分析。此外，通過搜索用戶補(bǔ)充的質(zhì)譜庫可輕松鑒定未知化合物。