摘要：本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)/6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)建立 了 4 種硝基呋喃代謝物（包括呋喃他酮 AMOZ、呋喃西林 SEM、呋喃妥因 AHD 和呋喃唑酮 AOZ）的分析方法。動(dòng)物源性樣品（肌肉、內(nèi)臟、蜂產(chǎn)品、水產(chǎn) 品、乳制品等）經(jīng)過(guò)鹽酸水解衍生、乙酸乙酯提取后，采用薄殼型填料反相 C18 色譜柱 — Agilent Poroshell 120 EC-C18 分離，經(jīng)配有安捷倫噴射流 (AJS) 電噴霧離子 源的安捷倫三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)在正離子模式下監(jiān)測(cè)。該方法在 0–5 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù) R2 ≥ 0.995；在 0.5 µg/kg 添加濃度下，各 化合物峰面積 RSD 均小于 2%；各化合物定量下限均可達(dá)到 0.25 µg/kg。通過(guò)對(duì) 方法靈敏度、精密度和線性范圍等方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行考察，得到所建立的方法能 在 12 min 內(nèi)對(duì) 4 種硝基呋喃代謝物完成快速、高靈敏度的檢測(cè)分析，同時(shí)采用 同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定，*法規(guī)監(jiān)測(cè)要求。

前言：硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真 菌和原蟲等病原體均有殺滅作用。它們作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制乙酰輔酶 A， 干擾微生物糖類的代謝，從而起抑菌作用。硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮、 呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因，曾廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，以治療由 大腸桿菌、埃希氏菌或沙門氏菌所引起的腸炎、疥瘡、赤鰭病、潰瘍病等動(dòng)物消 化道疾病。研究發(fā)現(xiàn)呋喃西林、呋喃唑酮及其代謝物 3-氨基-2-惡唑酮 (3-amino-2- oxazolidinone, AOZ) 等具有致癌作用。歐盟已于 1995 年禁止在食用動(dòng)物中使用硝基 呋喃類藥物，我國(guó)也于 2002 年頒布了禁止使用該類獸藥的禁令[1-3]。目前硝基呋喃類藥物是國(guó)際動(dòng)物源性食品貿(mào)易的必檢項(xiàng)目，成為發(fā)達(dá)國(guó) 家限制第三國(guó)出口的技術(shù)貿(mào)易壁壘。硝基呋喃類藥物對(duì)光敏 感，代謝快速，母體化合物在動(dòng)物體及其產(chǎn)品中很快就降至 檢測(cè)限以下，但其代謝物以蛋白結(jié)合物的形式在體內(nèi)可殘留 較長(zhǎng)時(shí)間。顯然檢測(cè)硝基呋喃類藥物母體化合物已不能反映 真實(shí)的用藥情況。目前各國(guó)均將硝基呋喃代謝物作為指示硝 基呋喃類藥物殘留的標(biāo)示物。

隨著液質(zhì)聯(lián)用儀和技術(shù)近年來(lái)的快速普及以及對(duì)此類禁用 藥物越來(lái)越苛刻的檢測(cè)限要求，液質(zhì)聯(lián)用儀已成為動(dòng)物 源性食品中硝基呋喃類藥物殘留量的主要檢測(cè)確證技術(shù)手 段，被廣泛應(yīng)用于監(jiān)督監(jiān)管[4]。目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)硝基呋喃類藥 物的主要參照標(biāo)準(zhǔn)包括：《GB/T 21311-2007 動(dòng)物源性食品中 硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法 高效液相色譜/串聯(lián) 質(zhì)譜法》，《GB/T 21167-2007 蜂王漿中硝基呋喃類代謝物殘 留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，《GB/T 20752-2006 豬 肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留 量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，《SN/T 1627-2005 進(jìn)出口 動(dòng)物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量測(cè)定方法 高效液相 色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》，《農(nóng)業(yè)部 781 號(hào)公告-4-2006 動(dòng)物源食品 中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 法》和《農(nóng)業(yè)部 783 號(hào)公告-1-2006 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代 謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》等[5-10]。由于屬于 禁用類藥物，其檢出為“零允許量”(Zero tolerance)，考慮 到 檢測(cè)靈敏度能力，硝基呋喃代謝物檢測(cè)限為 0.1 µg/kg。 針對(duì)此類禁用性藥物的嚴(yán)格及苛刻的監(jiān)測(cè)需求，本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)/6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用 系統(tǒng) (1290/6495 LC/QQQ) 建立了快速檢測(cè) 4 種硝基呋喃代 謝物的確證定量方法。該方法可以滿足動(dòng)物肌肉、內(nèi)臟、 水產(chǎn)品、蜂產(chǎn)品、乳制品等動(dòng)物源性食品中硝基呋喃殘留 量的監(jiān)測(cè)。

實(shí)驗(yàn)部分 試劑與化學(xué)品 所有試劑和溶劑均為色譜純級(jí)或者分析純級(jí)。甲醇、乙 腈和乙酸乙酯購(gòu)自德國(guó)默克 (MERCK)。甲酸、乙酸銨、磷 酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉和鄰硝基苯jia醛 (2-NBA) 購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司。硝基呋喃代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品（呋喃他酮 AMOZ、呋喃西林 SEM、呋喃妥因 AHD 和呋喃唑酮 AOZ）及 相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)（D5-AMOZ、13C3-SEM、13C3-AHD、D4-AOZ） 購(gòu)自德國(guó)奧格斯堡 (Dr. Ehrenstorfer)。 所有標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制為 1 mg/mL 儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存在 -20 °C 冰箱內(nèi)（有效期 1 年左右）。用乙腈:水 (50:50) 配制混合工 作液 (10 µg/mL)，儲(chǔ)存在 4 °C 下（有效期 1 個(gè)月左右）。其 中鄰硝基苯jia醛用甲醇配制為 100 mmol/L。 儀器配置 實(shí)驗(yàn)采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，其由 下列部件組成： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity 標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 自動(dòng)進(jìn)樣器冷卻器 (G1330B） • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C) 采用配有安捷倫噴射流 (AJS) 電噴霧離子源的 Agilent 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)。 采用 Agilent MassHunter 工作站軟件（B.07 或以上版本）進(jìn) 行數(shù)據(jù)采集、確證和定量分析。

樣品前處理 稱取 2 g 均質(zhì)后的樣品（精確至 0.1 g）于 50 mL 聚四氟乙烯 離心管中，加入 5 mL 0.2 mol/L 鹽酸、50 µL 100 mmol/L 鄰 硝基苯j(luò)ia醛溶液、100 µL 20 ng/mL 同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦動(dòng) 1 min，反應(yīng)混合物于恒溫箱中 37 °C 放置過(guò)夜。 取出樣品冷卻至室溫，加入 0.5 mL 0.3 mol/L 磷酸鈉水溶 液，用 2 mol/L 氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié) pH 約 7.2。然后，分 別用 5 mL 乙酸乙酯提取兩次，合并兩次乙酸乙酯提取液， 40 °C 氮?dú)獯蹈?。殘留物?1 mL 起始流動(dòng)相溶解，過(guò)濾膜 或高速離心后，待測(cè)。 液相色譜條件 色譜柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 100 mm, 2.7 µm 柱溫： 40 °C 進(jìn)樣量： 10 µL 自動(dòng)進(jìn)樣器溫度： 10 °C 流動(dòng)相： A) 含 2.5 mmol/L 乙酸銨和 0.1% 甲酸的水溶液 B) 乙腈 流速： 0.4 mL/min

梯度程序： 時(shí)間 B% 0 10 5.0 30 7.0 98 9.0 98 停止時(shí)間： 10 min 后運(yùn)行時(shí)間： 2 min 質(zhì)譜條件 離子模式： 正離子 干燥氣溫度： 200 °C 干燥氣流量： 15 L/min 鞘氣溫度： 370 °C 鞘氣流量： 12 L/min 霧化器壓力： 35 psi 毛細(xì)管電壓： 4000 V 噴嘴電壓： 0 V ? EMV 300 V MS1 和 MS2 分辨率 Unit MRM 參數(shù) 如表 1 所示

結(jié)果與討論 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)可充分滿足對(duì)此類藥物的 檢測(cè)要求，在 MRM 方法列表中給出了 6495 的碎裂電壓 (Fragmentor) 參考值。6495 具有新型的預(yù)四極桿離子傳輸聚 焦技術(shù)、彎曲錐形碰撞池及高能電子倍增管檢測(cè)器設(shè)計(jì)， 可以大大提高離子的聚焦傳輸，產(chǎn)生更有效的離子碎片及 更多的離子/電子轉(zhuǎn)化率，從而大大提高了靈敏度、穩(wěn)定性 及抗污染能力。 本文采用含有薄殼型填料顆粒的 Poroshell 120 EC-C18 色 譜柱對(duì)硝基呋喃代謝物進(jìn)行了有效的色譜分離，此填料 (2.7 µm) 和規(guī)格 (3.0 x 100 mm) 的色譜柱具有較高的分離柱 效和較高的柱載量，同時(shí)具有較低的色譜壓力，非常適合 分析動(dòng)物源性樣品基質(zhì)中藥物殘留。流動(dòng)相中添加 0.1% 甲 酸和 2.5 mmol/L 乙酸銨可以促進(jìn)正模式下的離子化效率。 所得結(jié)果如圖 1 所示。

圖 3. 蜂王漿基質(zhì)中添加 0.5 µg/kg 硝基呋喃代謝物的加標(biāo)樣品的 MRM 譜圖 由于考慮到色譜保留分離和靈敏度的需要，硝基呋喃代謝物 需要用鄰硝基苯j(luò)ia醛衍生后再分析測(cè)定，但需要注意代謝物 的衍生物穩(wěn)定性較差，需要處理完后盡快上機(jī)測(cè)定。另外不 同基質(zhì)樣本需要注意衍生化效率，必要時(shí)需要采用 SPE 凈 化后再衍生分析。所用處理試劑和對(duì)照品需要現(xiàn)用現(xiàn)配，避 免過(guò)期降解影響測(cè)定結(jié)果。本儀器方法適用于肌肉組織、內(nèi) 臟、蜂產(chǎn)品、水產(chǎn)品、乳制品等樣品中硝基呋喃代謝物的測(cè) 試分析。

結(jié)論 采用 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)/6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物源性食品中硝基呋喃禁用藥物殘留 量的高靈敏、快速確證定量分析。本方法以國(guó)內(nèi)發(fā)布檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，方法學(xué)各項(xiàng)參數(shù)*或高于標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)要求，并可應(yīng)用于各類動(dòng)物源性樣品基質(zhì)中硝基呋喃的快速 檢測(cè)。