前言 ：香料自古以來就被用于食品的調(diào)味和著色。歐洲國家發(fā)生過很多香料安全性警 告事件，涉及不同種類的污染物。因此，通過一種多殘留分析方法同時篩查和 定量農(nóng)藥、真菌毒素以及著色劑的需求越來越迫切。這類分析面臨的主要挑戰(zhàn) 包括復雜的基質(zhì)、大量的分析物、化合物種類的多樣性，以及分析方法必須覆 蓋寬泛的濃度范圍等。 本應用簡報評估了在動態(tài) MRM 和快速極性切換模式下運行的離子漏斗三重四極桿質(zhì)譜儀對一系列痕量水平分析物進行準確定量分析的性能。此外，我們還評 估了旨在優(yōu)化 MRM 間延遲時間的改良版軟件和固件，其能夠在低至 0.5 ms 的駐 留時間內(nèi)獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)。 Agilent 6495B 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)具有優(yōu)異的靈敏度，能夠精準定量高度 稀釋的樣品中的農(nóng)藥、真菌毒素和著色劑，在降低基質(zhì)效應的同時提高方法穩(wěn) 定性。

實驗部分 樣品前處理 黑胡椒和辣椒粉購自當?shù)仉s貨店，按 照 EN 15662 QuEChERS 前處理方法， 使用 Agilent BondElut QuEChERS 試劑 盒（部件號 5982-6650）進行提取。 使用 QuEChERS dSPE EMR-Lipid 增強 型脂質(zhì)去除凈化基質(zhì)試劑盒（部件 號 5982-1010）進一步純化提取物， 然后進行 Polish 凈化鹽析萃?。ú考?號 5982-0102）。最后，向提取物中加 入 2 ppb (10 µg/kg) 安捷倫綜合農(nóng)藥混 標（部件號 5190-0551）、真菌毒素以 及著色劑標準品 (Sigma)，再用乙腈以 1:5、1:10、1:20、1:50 和 1:100 的比例 稀釋加標后的提取物。 方法設計 使用 Agilent MassHunter 優(yōu)化軟件優(yōu)化 五種真菌毒素和九種著色劑的 MRM 離子對，并使用安捷倫農(nóng)藥觸發(fā)式多 反應監(jiān)測 (tMRM) LC/MS 應用套裝為 每種化合物確定至少兩個 MRM 離子 對及其對應的 MS 條件。采用正離子 和負離子電噴霧電離，在動態(tài) MRM (dMRM) 或 tMRM 模式下通過單次運 行執(zhí)行分析。主要的 UHPLC 和 dMRM MS 參數(shù)如儀器條件表所示。

結果與討論 評估經(jīng)優(yōu)化的 MRM 間延遲時間 我們開發(fā)了以 100 個 MRM 離子對（代 表 53 種農(nóng)藥）為分析目標的方法，用 于評估優(yōu)化了 MRM 間延遲時間的改 良版軟件和固件。圖 1 顯示了四個不 同的駐留時間內(nèi)兩種農(nóng)藥的疊加 MRM 色譜圖，表明合適的 MRM 延遲時間 對于在短駐留時間內(nèi)保持離子信號非 常重要。

方法開發(fā)及性能 我們首先采用針對目標真菌毒素和著 色劑化合物進行了優(yōu)化的新離子對開 發(fā)了 MRM 方法。隨后，使用新的化 合物離子對和觀察到的保留時間數(shù)據(jù) 更新以 250 多種農(nóng)藥為目標的 dMRM 方法。 UHPLC 與經(jīng)過優(yōu)化的 6495B 三重四極桿質(zhì)譜儀相結合，能夠在大多數(shù)分析 物最大殘留* (MRL) 10% 的定量下 限 (LLOQ) 水平對其進行定量分析。在 低至 2 ppt 的 LLOQ 到高至 100 ppb 的定 量上限 (ULOQ) 范圍內(nèi)，采用 13 個濃 度水平的標樣評估方法的精度和準確 度，每個濃度執(zhí)行五次重復進樣。所 得結果表明，分析的精度（LLOQ 處的 RSD% < 20%，其余濃度水平 < 15%） 和平均準確度（LLOQ 處為 80%-125%， 其余濃度水平為 85%-115%）都很出色。 校準曲線的相關系數(shù) (R2 ) 大于 0.99。

通過稀釋提取物最大限度降低基 質(zhì)效應 對復雜樣品提取物進行稀釋能夠最大 限度降低基質(zhì)效應，使得定量分析更 加準確，同時還能減少液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) 所受的污染，從而提高分析穩(wěn)定性。 表 1 顯示了稀釋操作對分析結果的改 善，其中黑胡椒樣品中化合物的回收 率隨著樣品被進一步稀釋而提高。 香料是一類非常具有挑戰(zhàn)性的食品基 質(zhì)，它們的性質(zhì)很復雜，因而離子抑 制效應極為顯著。由于觀察到了著色 劑化合物損失，我們不能利用傳統(tǒng)分 散式固相萃取凈化來去除干擾性基質(zhì) 化合物，這又導致基質(zhì)效應進一步增 強。因此，稀釋提取物對于降低離子 抑制效應而言十分關鍵，圖 4 中的對 比結果表明，不同類型的香料適用的 稀釋比例差別非常大。 我們所分析的樣品中十分具有挑戰(zhàn)性的 香料基質(zhì)是黑胡椒。圖 5 表明，要使 化合物回收率達到 > 90% 的可接受標 準，需要使用乙腈以 1:100 的比例稀釋 提取物。6495B 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)固有的靈 敏度能夠有效分析以適合比例 1:100 稀釋的黑胡椒樣品，同時仍能檢出大 多數(shù)化合物，且峰面積 RSD < 20%。

使用觸發(fā)式多反應監(jiān)測 (tMRM) 進行確證分析 使用 dMRM 方法評估基質(zhì)效應時， 我們發(fā)現(xiàn)辣椒粉的空白提取液（未加 標）中存在 20 多種農(nóng)藥和真菌毒素。 為了進一步確認此對照樣品中的這些 化合物，我們使用 tMRM 方法，在一 個主要離子對的基礎上采集了多達六個離子對，然后將完整的化合物譜圖 與采用純標準品創(chuàng)建的譜庫進行比 對。定量分析也使用相同的數(shù)據(jù)。在 圖 6 所示的例子中，以 1:20 比例稀釋的 辣椒粉提取物中赭曲霉毒素 A 和黃曲 霉毒素 B1 的計算結果分別為 28 µg/kg 和 8.1 µg/kg。

結論 • 使用優(yōu)化的 MRM 間延遲時間能 夠?qū)⑺?MRM 駐留時間縮短至 0.5 ms，同時最大限度減小分析 物信號損失 • 真菌毒素和著色劑化合物被成 功納入 UHPLC/MS/MS 農(nóng)藥方 法的目標分析物中，用于測定 260 余種化合物 • 使用 Agilent 6495B 液質(zhì)聯(lián)用系 統(tǒng)可提高分析靈敏度，精準定 量高度稀釋的香料提取物中的 化合物，同時降低基質(zhì)效應并 提高方法穩(wěn)定性 • 本文還給出了香料中真菌毒素 化合物的確證分析所用的 tMRM 采集參數(shù)