前言：水產(chǎn)養(yǎng)殖是一個不斷增長的全球性行業(yè)；預計 2030 年以后全球產(chǎn)量可能超過 93000 噸1 。隨著產(chǎn)量提高而不斷增加的獸藥使用量已成為全球關(guān)注的問題。雖然 針對水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥和非處方抗生素的使用有相應的控制和監(jiān)管措施，但某些國家 對耐藥性和毒性的擔憂仍在不斷增加。美國食品進口量持續(xù)增長，因而愈發(fā)需要一 種快速靈敏的篩查技術(shù)，用于檢測海鮮中未經(jīng)批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥。多家制造商 已經(jīng)開發(fā)出使用酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) 來測定獸藥殘留的快速篩查方案。性 能最佳、靈敏度最高的儀器方法當選高效液相色譜 (HPLC) 與串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS 或三重四極桿/MS）聯(lián)用系統(tǒng)，該儀器平臺可顯著降低背景信號，還能夠準確定量 測定樣品基質(zhì)中濃度極低的獸藥2 。 另一方面，Ionsense, Inc. 的實時直接分析質(zhì)譜 (DART-MS) 有利于對組織制品中的各 類獸藥進行實時實驗室分析，同時省去了典型 HPLC-MS 所需的標準方案和程序。 通常采用費時的 ELISA 試劑盒分析個別的目標獸藥，借助 DART-MS 進行分析可以實 時、同步地檢測多種獸藥類別。

開發(fā)如 DART-MS 的離子源技術(shù)，以便在 大氣壓/地電位（分子電離至帶電狀態(tài)所 消耗的能量）對材料和樣品基質(zhì)進行 快速、非接觸分析。將揮發(fā)性樣品引入到 一個真空源中，在那里與亞穩(wěn)態(tài)原子相反 應而發(fā)生電離。該技術(shù)誕生于 2005 年， 首先在州和聯(lián)邦實驗室中用于篩查人用非 法藥物，并且已通過 HPLC-MS 技術(shù)驗證 為確證性方法。它已經(jīng)有一些成功應用 的示例，包括藥物、代謝物、肽和低聚 糖、合成有機物、有機金屬化合物、濫用 藥、爆炸物和有毒工業(yè)化學品等的檢測。 DART-MS 當前用于混凝土、瀝青、人體 皮膚、貨幣、航空公司登機牌、名片、水 果、蔬菜、香料、飲料、體液、園藝樹 葉、雞尾酒杯和服裝等各種表面，它可以 實時地提供瞬間響應，這對于提高通量和 增強分析能力至關(guān)重要3 。 三重四極桿MS 技術(shù)已得到成功應 用。它以 Agilent iFunnel 技術(shù)的高性能為 基礎(chǔ)，其中包括 Agilent 6495 三重四極桿 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠檢測極低濃度 的獸藥。6495 系統(tǒng)將分析靈敏度、動態(tài) 范圍、耐用性、精密度和準確度提升至水平4 。本應用簡報介紹了安捷倫技術(shù) iFunnel 與 DART 離子源 的實時分析能力結(jié)合的新用途，即，對添 加獸藥混標至海鮮組織中的蝦和魚類海鮮 基質(zhì)進行分析。

使用 Agilent 6400 系列三重四極桿/MS， 以全面考察 DART 和 HPLC-ESI（電噴霧 離子化）的功能，這是通過 Agilent 1290 HPLC-6495 系統(tǒng)和 DART-6495 系統(tǒng)并行 地分析一系列獸藥來實現(xiàn)（圖 1）。

實驗部分 使用 Agilent 6495 iFunnel（三重四極桿 質(zhì)譜儀，型號 G6495A）和 Ionsense, Inc. 帶 Vapur 接口的 SVP-DART 對分析物進行 分離。分析九種獸藥的混合標樣（圖 2， Sigma-Aldrich），測定 平臺對 這些組分的定量限、檢測限、線性動態(tài)范 圍和分析靈敏度等基準資料。

采用 Agilent Bond Elut 增強型脂質(zhì)去除產(chǎn)品 (EMR―Lipid) 萃取魚蝦組織。EMR―Lipid dSPE 試劑盒包括分散吸附劑，其被預稱 量置于 15 mL 離心管中（EMR―Lipid，部 件號 5982-1010），還包括經(jīng)過預包裝的 MgSO4 拋光粉（部件號 5982-0102）。 將大約 15 g 的白蝦 (l. setiferus) 和 5 g 羅 非魚 (Oreochromis spp) 轉(zhuǎn)移至陶瓷研 缽中，將其*浸軟以裂解組織的細胞 壁。將 2 g 浸軟的組織轉(zhuǎn)移至 50 mL 聚 丙烯離心管中。在水中制備各個加標化 合物之后（例外：氯霉素使用購自 Fisher Chemical 的 LC/MS 級乙醇進行配置）， 使用去離子水為圖 2 中列出的 9 種藥物 配置混合加標溶液。該混合溶液的加標 濃度為：500 ppb、250 ppb、100 ppb、 50 ppb 和 10 ppb。 組織加標后，靜置樣品 15 分鐘。接著， 將加標組織渦旋混合 30 秒，然后將 10 mL 含 5% 甲酸的乙腈溶液（Fisher Chemical， LC/MS 級）加入離心管中。將離心管渦旋 混合 1 分鐘，并在 4000 rpm 的轉(zhuǎn)速下離 心 10 分鐘。離心后，另將 5 mL 的 5 mM 乙酸銨加到已預裝分散固相萃取劑的 15 mL 聚丙烯管（部件號 5982-1010）中 渦旋混合 1 分鐘，活化 EMR―Lipid 分散 吸附劑。也可以在后續(xù)實驗中使用 18Ω 純水，得到更出色的結(jié)果。在分散步驟中 用純水替代乙酸銨的方案將在隨后的文章 中發(fā)布。

渦旋混合分散吸附劑和乙酸銨后，立即將 所提取樣品管中的 5 mL 上清液加到包含 分散吸附劑和乙酸銨的離心管中，渦旋 混合 1 分鐘，并在 4000 rpm 的轉(zhuǎn)速下離 心 10 分鐘。然后將全部萃取液從 EMR― Lipid 離心管中傾析到一個 50 mL 離心管 中，并加入一整袋 MgSO4 拋光粉。先搖 晃該離心管，再渦旋混合 1 分鐘，并在 4000 rpm 的轉(zhuǎn)速下離心 10 分鐘。然后 將包含 MgSO4 粉末的離心管上層轉(zhuǎn)移到 干凈的 15 mL 聚丙烯管中，并在 65±5 °C 的水浴上使用 N2 進行吹掃蒸發(fā)，直至管 中留有 10 μL 內(nèi)容物。

將 15 mL 聚丙烯管中的內(nèi)容物復溶于 100 µL 1:1 的 5 mM 甲酸銨/甲醇（Fisher Chemical，LC/MS 級）中。將管中復溶物 渦旋混合 30 秒。DART QuickStrip 卡的每 個篩查點上用 5 μL 溶液進行點樣。要完 成 HPLC 分析，將 50 µL 復溶溶液轉(zhuǎn)移至 2 mL 微量離心管中離心 30 秒。隨后，將 30 µL 離心后溶液轉(zhuǎn)移至帶有聚合物內(nèi)插 管（部件號 5180-1270）的安捷倫 HPLC 樣品瓶中。圖 3 展示了 Agilent Bond Elut EMR―Lipid dSPE 的流程圖。圖 4 以圖形 方式展示了 Bond Elut 增強型基質(zhì)去除試 劑盒增強的凈化效果。

……

結(jié)果與討論 要校正樣品的基質(zhì)干擾效應，可通過分析 蝦和魚組織與基質(zhì)匹配的混合標樣（使用 獸藥標樣加標的組織樣品），確定所檢組 織中獸藥的檢測限。根據(jù)第二次分析的 DART 結(jié)果（圖 6），所有與基質(zhì)匹配的 獸藥標樣在濃度為 50 ppb 時均可檢出， 且若干與基質(zhì)匹配的獸藥還可在濃度低至 1 ppb 時檢出。圖 11 和 12 展示了使用濃 度為 1 ppb 的基質(zhì)匹配標樣得到的環(huán)丙沙 星和氟甲喹的 數(shù)據(jù)結(jié)果。 要校正樣品基質(zhì)干擾效應，可使用方案分析中的與基質(zhì)匹配 的混合標樣，確定所檢組織中獸藥的檢測 限。如恩諾沙星示例所示（圖 13），基質(zhì) 匹配標樣濃度為 10 ppt 時，其中的目標 分析物可輕松檢出。