摘要：基于多屬性方法 (MAM) 的 LC/MS 肽譜分析在生物制藥分析領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān) 注。本應(yīng)用簡報(bào)展示了使用 LC/MS 肽譜分析方法對(duì)不同單克隆抗體 (mAb) 的關(guān)鍵質(zhì) 量屬性 (CQAs) 進(jìn)行的表征和定量分析。將肽譜分析結(jié)果與傳統(tǒng)方法進(jìn)行了比較，結(jié) 果表明，肽譜分析與傳統(tǒng)方法對(duì)賴氨酸截短、氧化、脫酰氨基化、N 端環(huán)化和糖基 化程度的估算高度相似

前言：單克隆抗體 (mAbs) 來自正處于快速生長 期的生命系統(tǒng)。由于其生物來源，這些復(fù) 雜分子在生產(chǎn)過程中會(huì)經(jīng)歷各種翻譯后 修飾 (PTMs)，從而導(dǎo)致明顯的異質(zhì)性。 在 mAbs 的開發(fā)和生產(chǎn)過程中，將這些 意外修飾作為 CQAs 進(jìn)行表征和監(jiān)測至關(guān) 重要。由于每種 CQA 的化學(xué)性質(zhì)不同， 傳統(tǒng)上有幾種檢測方法可執(zhí)行此分析，每 種技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。近年來，基于 LC/MS 的多屬性方法 (MAM)[1] 獲得了廣 泛的應(yīng)用，因?yàn)樗型峁┮环N對(duì) mAb CQAs 進(jìn)行全面表征的單一方法，與傳統(tǒng) 方法相比，該方法可有效節(jié)省分析時(shí)間和 成本。然而，在將 MAM 方法應(yīng)用于嚴(yán)格 監(jiān)管的質(zhì)量控制環(huán)境之前，必須先驗(yàn)證傳 統(tǒng)分析方法與肽譜分析結(jié)果的對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確 性。重要的是確保肽譜分析工作流程可提 供與傳統(tǒng)分析方法相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。本研究比較了肽譜分析方法與傳統(tǒng)分析 方法（包括離子交換色譜法、親水相互 作用色譜法 (HILIC) 和亞基水平反相色譜 法）的性能。使用由 Agilent AssayMAP Bravo 液體處理平臺(tái)、Agilent  1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)和 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF，以及用于數(shù)據(jù)分 析的 Agilent MassHunter BioConfirm 軟件 組成的一體化工作流程對(duì) mAbs 進(jìn)行了肽 譜分析。比較了肽譜分析方法與傳統(tǒng)分析 方法對(duì)各 CQA 的相對(duì) (%) 定量結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)部分：材料 mAb1、mAb2 和 mAb3 購自當(dāng)?shù)亟?jīng)銷商 （新加坡），并根據(jù)制造商的使用說明進(jìn) 行儲(chǔ)存。三羥甲基氨基甲烷、Tris-HCl、 鹽酸胍、三(2-羧乙基)膦 (TCEP)、碘乙 酰胺 (IAA)、甲酸、三氟yi酸、磷酸二氫 鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉和 LC/MS 級(jí)溶 劑購自 Sigma-Aldrich。IdeS 蛋白酶購自 Genovis。高品質(zhì)測序級(jí)胰蛋白酶來自安 捷倫科技公司。

實(shí)驗(yàn)方法 電荷異構(gòu)體：將樣品直接進(jìn)樣，無需稀釋 (10 mg/mL)。表 1 和表 2 列出了 mAb1 和 mAb2 針對(duì)弱陽離子交換 (WCX) 色譜 法的色譜參數(shù)。對(duì)收集的 WCX 餾分進(jìn)行 了胰蛋白酶酶解和肽譜分析。 氧化：將 5 µL mAb 樣品（2 mg/mL，溶于 Tris-HCl 緩沖溶液）加入 5 µL IdeS 蛋白酶 中，30 °C 下孵育 30 分鐘，冷卻至室溫 后進(jìn)行分析。 游離多聚糖：使用 AssayMAP Bravo 液體 處理系統(tǒng)和 GlykoPrep 快速 N-糖試劑盒 (GPPNG-PC) 進(jìn)行標(biāo)記 N-糖樣品前處理[2]。 通過 HILIC 實(shí)現(xiàn)標(biāo)記 N-糖的分離。 胰蛋白酶酶解 將收集的 WCX 樣品和 mAb 樣品餾分還 原/烷基化，并用胰蛋白酶酶解，然后 使用 Agilent AssayMAP Bravo 液體處理 平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行脫鹽處理[3]。簡而言之， 將含有 mAbs 的樣品板復(fù)溶于變性緩沖 液（含 5 mmol/L TCEP 和 150 mmol/L Tris 的 8 mol/L 鹽酸胍，pH 8）中，并 在 60 °C 下溫育 60 分鐘。在進(jìn)行變性和 二硫鍵還原后，加入 133 mmol/L 碘乙酰 胺（室溫下 40 分鐘）對(duì)游離的半胱氨酸 進(jìn)行烷基化。然后將樣品酸化并用 1.75% TFA 進(jìn)行稀釋。接下來，使用 RP-W 小柱 對(duì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)純化應(yīng)用，并在 37 °C 下進(jìn)行胰蛋白酶過夜酶解（蛋白質(zhì)與 蛋白酶比例 20:1，w:w）。隨后，通過 AssayMAP 試劑轉(zhuǎn)移工具使用 0.1% 甲 酸對(duì)樣品進(jìn)行酸化，以終止胰蛋白酶的 活性。使用 C18 反相柱執(zhí)行 AssayMAP Bravo 肽段純化方案（脫鹽）。

結(jié)果與討論 C 端賴氨酸截短 由于羧肽酶的活性，重鏈 C 端賴氨酸的 截短是常見的 PTM。賴氨酸殘基的丟失 會(huì)減少 mAbs 的凈正電荷，從而導(dǎo)致電 荷異質(zhì)性。通過陽離子交換色譜 (CEX) 可 以很好地分離 C 端賴氨酸異構(gòu)體（含賴 氨酸和不含賴氨酸)。圖 1A 顯示了使用 Agilent Bio MAb PEEK 色譜柱分析 mAb1 獲得的電荷異構(gòu)體圖譜的高分離度分離和 三個(gè)不同的峰。13.11 分鐘處的峰記為主 峰 (M)。早洗脫和晚洗脫峰分別稱為酸性 異構(gòu)體（A1 和 A2）和堿性異構(gòu)體（B1、 B2、B3、B4、B5 和 B6）。圖 1A 的表格 列出了主峰、酸性電荷異構(gòu)體和堿性電荷 異構(gòu)體的峰面積百分比。在通過 LC/MS 肽譜分析表征 C 端賴氨酸截短之前，將 電荷異構(gòu)體峰收集作為單個(gè)餾分，并將 多次進(jìn)樣的結(jié)果進(jìn)行合并?；陔淖V分 析，使用 C 端賴氨酸截短異構(gòu)體對(duì) CEX 峰進(jìn)行標(biāo)注。通過羧肽酶 B (CPB) 處理， 進(jìn)一步證實(shí)了 C 端賴氨酸的異質(zhì)性。由 電荷異構(gòu)體峰的面積百分比計(jì)算得到的 C 端賴氨酸截短的相對(duì)含量為 58.28%

在基于肽譜分析的 C 端賴氨酸異構(gòu)體圖 譜定量中，對(duì) mAb1 進(jìn)行了 LC/MS 肽譜 分析。圖 1B 所示為 mAb1 的 LC/MS 肽 譜分析結(jié)果。MS/MS 分析確認(rèn)了修飾和 未修飾重鏈 C 端賴氨酸截短肽的歸屬， 并鑒定得到其相對(duì)含量為 55.30%。 表 3 所示為傳統(tǒng) CEX 和肽譜分析方法用 于 C 端賴氨酸截短異構(gòu)體定量的比較。 兩種方法估算的 C 端賴氨酸截短的相對(duì) 含量相當(dāng)。