摘要：孕酮及其代謝物對女性具有重要作用，因此常用于激素替代療法。然而目前的研究表明，孕酮（合成孕酮）可在多種疾病中發(fā)揮重要作用，尤其是乳腺癌。本文介紹的安捷倫LC/MS/MS 方法采用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜儀和 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，適用于分析孕酮及相關(guān)依賴性激素，其中包括孕酮、3α-/5α-/20α-二氫孕酮以及別孕烯醇酮、孕烯醇酮和脫氧皮質(zhì)酮。

前言：除雌激素外，孕酮及其代謝產(chǎn)物在乳腺癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，會增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險[1,2]。對乳腺組織和腫瘤乳腺組織的檢查結(jié)果顯示有三種孕酮代謝產(chǎn)物參與其中：3α-、5α- 和 20α-二氫孕酮[1,3]。除孕酮外，5α-二氫孕酮還具有促進乳腺癌發(fā)展的作用，而另外兩種代謝產(chǎn)物 3α-和 20α-二氫孕酮則會抑制乳腺癌的發(fā)展[4]。到目前為止，孕激素和孕酮已廣泛用于激素替代療法，但由于化學(xué)性質(zhì)不同，其作用可能有所相同，可能引起負面的副作用[5]。本文開發(fā)的 LC/MS/MS 方法旨在用作一種分析男性和女性血清中激素水平的方式。

標樣配制和校準曲線繪制所有分析物均溶于乙腈中。然后使用乙腈配制濃度為 1 mg/L 的混合物。配制 7 個濃度的標樣，涵蓋 5 ng/L–1 µg/L 的工作范圍。將內(nèi)標溶于乙腈中制成濃度為1 µg/L 的溶液。由于沒有可用的市售質(zhì)控品，故用含 0.1% BSA 的 PBS 溶液進行配制。質(zhì)控品的濃度涵蓋標樣組的中低濃度范圍。

樣品前處理取等量標樣、質(zhì)控品或血清樣品 (400 µL)，然后加入 50 µL 內(nèi)標。向樣品中加入 5 mLMTBE，用于提取孕酮代謝產(chǎn)物。然后，將樣品渦旋混合，并在 4700 rpm 下離心5 分鐘。轉(zhuǎn)移有機上清液，在 45 °C 下用氮氣吹干。用 600 µL 1 mol/L 羥胺溶液 (0.5% NaOH)復(fù)溶殘留物，渦旋混合。在 90 °C 下進行衍生化反應(yīng)，持續(xù) 15 分鐘。反應(yīng)期間，以500 rpm 的轉(zhuǎn)速振搖溶液。冷卻后，加入5 mL MTBE，渦旋混合物。離心后（5 分鐘，4700 rpm），除去上清液，并在 45 °C下用氮氣吹干。然后用 100 µL 水/乙腈(70%/30%) 復(fù)溶殘留物，并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中進行分析。

數(shù)據(jù)分析采用 Agilent MassHunter 采集軟件(B.08.00) 進行數(shù)據(jù)采集。采用 AgilentMassHunter 定量分析軟件 (B.08.00) 對數(shù)據(jù)進行分析。使用所用內(nèi)標（孕酮-2,3,4-13C3）對所有分析物進行校正，以排除基質(zhì)效應(yīng)。

結(jié)果與討論LC/MS/MS 方法能夠分離所有孕酮代謝產(chǎn)物，如圖 1 中的示例血清樣品所示。異構(gòu)體也可成功得到相關(guān)分離。

分析驗證顯示，分析內(nèi)和分析間精度符合要求，所有數(shù)值均低于 10%。除定量限 (LOQ) 和線性數(shù)據(jù)外，精度數(shù)據(jù)如表 2所示。為檢測 LC/MS/MS 方法，對男性和絕經(jīng)后女性的血清樣品進行處理和測定。兩個性別相關(guān)孕酮的相關(guān)激素值和比值結(jié)果相似（表 3）。

結(jié)論本應(yīng)用簡報中介紹的 LC/MS/MS 方法可以可靠地測定孕酮及相關(guān)代謝產(chǎn)物。達到的LOQ 還有助于在自然孕酮水平較低的男性和絕經(jīng)后女性中測定這些激素。需要注意的是，樣品前處理過程非常復(fù)雜，且會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響；因此需要格外小心。孕酮和 20α-二氫孕酮的測定結(jié)果與文獻值（括號中的值）相當：男性孕酮為48.2 ng/L (42 ng/L)，女性孕酮為 27.9 ng/L(34 ng/L)，男性 20α-二氫孕酮為 58.3 ng/L(39 ng/L)，女性 20α-二氫孕酮為 40 ng/L(40 ng/L)。同樣，5α- 和 3α-二氫孕酮之間的比值與文獻值十分相近（10.9 與 9）[4]。文獻中 3α- 和 5α-二氫孕酮的比值明顯較高，可能是由于使用了另一種內(nèi)標[4,6]。