文 獻(xiàn) 精 讀
再帕爾 · 阿不力孜科研團(tuán)隊(duì) 第33期
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所
天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
文獻(xiàn)整理：尕曼 指導(dǎo)教師：賀玖明
本課題組在《PNAS》上發(fā)表了一篇題為“Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations”的研究論文，采用AFADESI-MSI技術(shù)，建立了空間分辨的原位代謝組學(xué)方法，并提出一種“下游代謝物與上游代謝酶關(guān)聯(lián)” 的研究策略來表征腫瘤代謝改變；結(jié)合免疫組化分析驗(yàn)證，從代謝物和代謝酶兩個(gè)層次和組織原位深入探究食管癌的代謝改變，發(fā)現(xiàn)并可視化表征了食管癌異常的代謝通路及其代謝酶。*的代謝模式是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的重要特征，越來越多的研究表明，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生特定譜式的代謝改變以適應(yīng)腫瘤生長。對于不同組織來源的腫瘤細(xì)胞，盡管彼此間的基因變異譜千差萬別，但是，幾乎所有的腫瘤都需要通過類似的代謝重編程（Metabolic Reprogramming）來維持其無限制的細(xì)胞增殖。腫瘤代謝的表征能夠?yàn)榘┌Y病理機(jī)制研究、腫瘤診療新指標(biāo)和干預(yù)靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供新的契機(jī)。然而，到目前為止，如何全面的發(fā)現(xiàn)腫瘤的異常代謝，尤其是如何從代謝物和代謝酶兩個(gè)層面上原位地表征腫瘤的異常代謝仍然面臨非常大的困難。收集256例人鱗片狀食管癌（ESCC）組織標(biāo)本，包括癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)端非癌組織，制成冰凍組織切片。如圖1所示，采用空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像技術(shù)（AFADESI-MSI），采集上述組織中內(nèi)源性代謝物及其空間分布信息；對相鄰切片進(jìn)行HE染色；采用MassImager質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)處理軟件，使質(zhì)譜成像圖與HE染色圖匹配重合，按不同組織類型及空間分布提取代謝物輪廓信息；使用SIMCA軟件進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，篩選出與腫瘤代謝相關(guān)的差異代謝物；根據(jù)差異代謝物及其鑒定結(jié)果富集分析發(fā)生變化的代謝通路及推測關(guān)鍵代謝酶；采用免疫組化方法檢測鎖定的代謝酶表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證其與代謝標(biāo)志物是否具有同樣的空間分布特征。圖1 采用空間分辨的原位代謝組學(xué)研究策略，發(fā)現(xiàn)腫瘤代謝變化
1 脯氨酸生物合成上調(diào)
脯氨酸作為細(xì)胞微環(huán)境中的重要氨基酸參與細(xì)胞凋亡和自噬，在癌癥代謝中的重要作用得到越來越多的關(guān)注。根據(jù)256個(gè)食管癌組織樣本的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，癌區(qū)脯氨酸離子強(qiáng)度顯著高于上皮和肌肉區(qū)(P<0.001，圖2C)。采用免疫組化方法檢測與脯氨酸合成相關(guān)的關(guān)鍵代謝酶吡咯-5-羧酸還原酶2（PYCR2）在ESCC組織切片中的空間表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PYCR2只在癌區(qū)表達(dá)(圖2e)，與食管癌組織中脯氨酸的空間分布一致。圖2 脯氨酸生物合成途徑中關(guān)鍵代謝物和代謝酶的原位分析（A）脯氨酸的質(zhì)譜成像（B）光學(xué)-MSI重疊圖像（C）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中脯氨酸水平 ***p<0.001（D）ESCC組織的HE染色圖 （E）不同ESCC組織中PYCR2的表達(dá) CT，癌組織；ET，上皮組織；MT，肌肉組織
2 尿苷代謝上調(diào)
尿苷是RNA合成的重要核苷前體，也參與嘌呤核苷酸生物合成和碳水化合物代謝。此外，組織中尿苷的水平對于嘧啶類抗代謝藥物的抗腫瘤治療至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)癌組織中尿苷含量高于上皮組織而低于肌肉組織（P<0.001,圖3 A1和A3），而尿嘧啶的含量在癌組織中顯著升高（P<0.001,圖3 A2和A4），尿嘧啶/尿苷離子強(qiáng)度比（圖3A6）在癌區(qū)顯著增加，可以作為區(qū)分癌組織與癌旁正常組織的生物標(biāo)志物。同樣，免疫組化結(jié)果顯示催化尿嘧啶生成尿苷的代謝酶尿苷磷酸化酶1(UPase 1)在癌組織中的表達(dá)上調(diào)。圖3A 尿苷代謝途徑中關(guān)鍵代謝物和代謝酶的原位分析（A1，A2）尿苷和尿嘧啶的質(zhì)譜成像圖 （A3，A4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中尿苷和尿嘧啶水平 ***p<0.001（A5）UPase 1介導(dǎo)的尿苷轉(zhuǎn)換為尿嘧啶的代謝過程（A6）根據(jù)尿嘧啶/尿苷離子強(qiáng)度比值構(gòu)建的質(zhì)譜成像圖 （A7）癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中尿苷和尿嘧啶的強(qiáng)度變化（A8）ESCC不同區(qū)域UPase 1的表達(dá) CT，癌組織；ET，上皮組織；MT，肌肉組織
3 組胺代謝下調(diào)
組氨酸在組氨酸脫羧酶(HDC)的介導(dǎo)下代謝為組胺。有越來越多的證據(jù)顯示組胺直接參與致癌作用，可以作為一種潛在的細(xì)胞保護(hù)劑來改善癌癥治療。根據(jù)一些研究者的說法，基于組胺的治療能促進(jìn)癌細(xì)胞中DNA損傷、凋亡和衰老并可以顯著增加患癌動(dòng)物的存活率。在本研究中，組氨酸和組胺呈現(xiàn)*相反的空間分布。根據(jù)256例食管癌組織樣本的成像數(shù)據(jù)，組氨酸在癌組織中顯著上調(diào)而組胺顯著下調(diào)。組胺與組氨酸的離子強(qiáng)度差異如圖3B7所示。通過計(jì)算組胺與組氨酸的離子強(qiáng)度比，對HDC介導(dǎo)的組氨酸脫羧反應(yīng)進(jìn)行了研究(3B6)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的脫羧率相對于肌肉和上皮組織較弱。和基于強(qiáng)度比的質(zhì)譜成像預(yù)測的一致，腫瘤組織的HDC表達(dá)水平低于肌肉組織和上皮組織。圖3B 組胺代謝途徑中關(guān)鍵代謝物和代謝酶的原位分析 （B1，B2）組氨酸和組胺質(zhì)譜成像圖（B3，B4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中組氨酸和組胺水平 （B5）HDC介導(dǎo)的組氨酸轉(zhuǎn)換為組胺的代謝過程（B6）根據(jù)組胺/組氨酸離子強(qiáng)度比值構(gòu)建的質(zhì)譜成像圖（B7）癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中組氨酸和組胺的離子強(qiáng)度變化（B8）ESCC不同區(qū)域HDC的表達(dá)
此外，發(fā)生改變的代謝途徑還有谷氨酸代謝，脂肪酸合成以及多胺的生物合成，均在腫瘤組織中表現(xiàn)為顯著增多，相應(yīng)的免疫組化結(jié)果也證明與上述途徑有關(guān)的關(guān)鍵代謝酶在癌區(qū)的表達(dá)也明顯上調(diào)。以下（表1）為通過256例食管癌患者組織樣本篩選出的發(fā)生改變的6條代謝途徑和相應(yīng)的關(guān)鍵代謝酶：表1 篩選出癌癥相關(guān)的代謝產(chǎn)物、代謝酶、代謝途徑
該研究建立了一種高靈敏的空間分辨的原位代謝組學(xué)方法，對食管癌潛在原位標(biāo)志物進(jìn)行了代謝通路分析，并對通路上相關(guān)聯(lián)代謝物的分布特征進(jìn)行原位可視化表征，分析其空間變化趨勢，發(fā)現(xiàn)了并驗(yàn)證了6個(gè)在食管癌中異常表達(dá)的代謝酶：吡咯-5-羧酸還原酶2(PYCR2)、谷氨酰胺酶(GLS)、尿苷磷酸化酶1(UPase1)、組氨酸脫羧酶(HDC)、脂肪酸合成酶(FASN)和鳥氨酸脫羧酶(ODC)，它們廣泛參與食管癌相關(guān)的腫瘤代謝過程，其中PYCR2和UPase1被*發(fā)現(xiàn)在食管癌中異常改變。研究結(jié)果表明脯氨酸生物合成，谷氨酸代謝，尿苷代謝，組氨酸代謝，脂肪酸合成，多胺生物合成等代謝通路在食管癌組織中發(fā)生了顯著變化。這些癌癥代謝相關(guān)信息有助于增加對癌癥代謝重編程的理解。基于AFADESI-MSI技術(shù)的空間分辨原位代謝組學(xué)方法，不僅可驗(yàn)證腫瘤原位標(biāo)志物的可靠性；同時(shí)針對腫瘤等具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組織，它具有原位、無需特殊標(biāo)記、無需復(fù)雜耗時(shí)的前處理及反復(fù)染色過程，能夠高通量地發(fā)現(xiàn)腫瘤異常變化的代謝通路及其代謝酶等優(yōu)勢；可從代謝物和代謝酶兩個(gè)層次全面表征腫瘤的代謝改變并發(fā)現(xiàn)其潛在功能，為深入探究腫瘤的代謝改變提供了全新的研究視角。Sun, C., et al. (2019). "Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations." Proceedings of the National Academy of Sciences 116(1): 52-57.
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