摘要：由于抗癲癇藥物種類繁多，而且這些藥物在人血清中的濃度可能差異很大， 導(dǎo)致監(jiān)測抗癲癇藥物非常具有挑戰(zhàn)性。因此，用于這些藥物的高品質(zhì)分析 必須能夠在多個數(shù)量級內(nèi)同步監(jiān)測多種化合物。液相色譜-質(zhì)譜 (LC/MS/MS) 法就特別適用于這種分析。為了定量分析人血清中 20 種抗癲癇藥物，開發(fā) 了一種靈敏度高、特異性好的方法。該方法通過一種簡單的蛋白質(zhì)沉淀/ 稀釋方案配制樣品?？稍谳^寬的動態(tài)范圍內(nèi)定量分析物，重現(xiàn)性以 及 R2 值都非常出色。

前言 液相色譜-質(zhì)譜 (LC/MS/MS) 檢測方 法的主要優(yōu)勢在于其可在一次進樣中 同時監(jiān)測多種分析物。本研究使用 LC/MS/MS 分析方法來定量分析人血 清中的一組 20 種抗癲癇藥物。與此相 反，由于相似分析物之間的濃度差異 較大，以往的分析通常只能監(jiān)測少數(shù) 幾種化合物。該組中的化合物包括： 乙酰瑞替加濱、卡馬西平-10,11-環(huán)氧 化物、卡馬西平、10,11-二氫-10-羥基 卡馬西平、非氨酯、加巴噴丁、拉科 酰胺、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奧卡 西平、苯妥英、普瑞巴 林、瑞替加濱、盧非酰胺、噻加賓、 托吡酯、丙戊酸、氨己烯酸和唑尼沙 胺。分析方法使用 Agilent 6460 三重四 極桿質(zhì)譜儀在寬濃度范圍內(nèi)同時檢測 這些化合物。各種分析物的校準(zhǔn)濃度 范圍為 12 ng/mL 至 200000 ng/mL。高 濃度范圍為 1.5 µg/mL 至 200 µg/mL。 通過將藥物標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)到空白人血清 中配制樣品。按照簡單的蛋白質(zhì)沉淀 方案配制用于分析的樣品和對照，然 后用水稀釋。進樣、分離分析物、清 洗色譜柱和重新平衡色譜柱在 10 分鐘內(nèi)完成。對 20 個目標(biāo)化合物中每個化 合物（包括丙戊酸）的兩個離子對進 行監(jiān)測。使用 15 個同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)來 顯示差異抑制，并確保色譜圖定量結(jié) 果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。另外還對磷脂 的離子對進行監(jiān)測，以驗證這類內(nèi)源 性分子的干擾小。 校準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度在低校準(zhǔn)濃度下在 預(yù)期濃度的 20% 內(nèi)，在較高濃度下在 15% 內(nèi)。重現(xiàn)性良好，CV 均小于 15%， 甚至大部分還小于 10%。所有 R2 值均 大于 0.997，其中一些化合物在濃度范 圍內(nèi)呈現(xiàn)線性響應(yīng)，而其他化合物則 需要二次擬合。

實驗部分 化學(xué)品與試劑 用于基質(zhì)匹配校準(zhǔn)物的人血清購自 UTAK Laboratories (Valencia, CA)。標(biāo)準(zhǔn) 品和內(nèi)標(biāo)購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 和 Cerilliant Corporation (Round Rock, TX)。樣品前處理和液相色譜溶 劑購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 和 Honeywell Riedel-de Haën (Seelze, Germany)。樣品前處理 將 20 種藥物標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)到空白人血清 中，得到高濃度樣品。用空白血清以 1:2 連續(xù)稀釋樣品，得到 7 個較低濃度 的樣品。將 40 µL 樣品或?qū)φ张c 40 µL 內(nèi)標(biāo)溶液在 120 µL 純甲醇中混合。將 樣品渦旋混合 30 秒后，在 10000 rpm 下離心 10 分鐘。然后取 50 µL 上清 液加入 450 µL 水中，取 4 µL 進樣到 LC/MS 系統(tǒng)。 數(shù)據(jù)分析 利用 Agilent MassHunter 采集軟件 (B.08.00) 進行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。 利用 MassHunter Acquisition Optimizer 軟件獲得 MS/MS 離子對，在進樣每 種化合物或內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤簳r確定的母離子和碎片離子、碎裂電壓和碰 撞能量。使用 Agilent MassHunter 定 量分析軟件 (B.08.00) 和定性分析軟件 (B.07.00) 分析數(shù)據(jù)。

結(jié)果與討論 線性 本方法使用 LC/MS/MS 在寬濃度范圍 內(nèi)同時檢測多種化合物（圖 1）。各種 分析物的校準(zhǔn)濃度范圍為 12 ng/mL 至 200000 ng/mL。高濃度范圍為 1.5 µg/mL 至 200 µg/mL，與曲線擬合參數(shù)一 起在表 1 中給出。所有 R2 值均大于 0.997，其中一些化合物在濃度范圍內(nèi) 呈現(xiàn)線性響應(yīng)，而其他化合物則需要 二次擬合