引言：傳統(tǒng)檢測(cè)單糖、雙糖的分析方法有化學(xué)法、光譜法、GCMS、HPLC等方法。其中化學(xué)法無法準(zhǔn)確測(cè)定單種糖的含量；光譜法的工作繁瑣、誤差比較大；GC-MS方法需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，前處理復(fù)雜，不利于快速分析；HPLC法雖然相比其他方法靈敏度好、檢測(cè)速度快、適用范圍廣，但也存在檢出限較低、抗干擾能力差，尤其對(duì)于食品中低濃度的單糖、雙糖很難進(jìn)行測(cè)定，無法滿足現(xiàn)階段對(duì)食品檢測(cè)快速、靈敏、準(zhǔn)確的要求。LCMS/MS技術(shù)通過質(zhì)譜的高選擇性和高靈敏度能夠降低目標(biāo)物的檢出限、提高檢測(cè)的重現(xiàn)性。由于糖類為水溶性化合物，在常規(guī)的C18色譜柱上沒有保留，而采用其他填料的親水色譜柱也很難得到太好的峰形或分離度。因此，選取一款合適的分析糖的色譜柱是液質(zhì)分析糖的實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)。目前專門測(cè)試糖的糖柱通常為液相柱，需要用到100%純水相來作為流動(dòng)相，并且流速通常高于1 mL/min，這樣的色譜條件對(duì)于大多數(shù)的質(zhì)譜離子源來說都無法實(shí)現(xiàn)化合物的有效離子化，或者只有通過分流才能實(shí)現(xiàn)，但是分流后將損失儀器的檢測(cè)靈敏度，失去了使用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)試糖的提高靈敏度的目的。 SCIEX 的LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的一大特點(diǎn)就是強(qiáng)大的 TurboV™離子源技術(shù)，離子源的加熱能夠達(dá)到750℃，ESI源耐受流速范圍 5 µL/min～3.0 mL/min，APCI源耐受流速范圍50 µL/ min～3.0 mL/ min，因此可以直接使用HPLC糖柱在SCIEX液質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行測(cè)試，即實(shí)現(xiàn)了好的分離效果，又提高了檢測(cè)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)使用SCIEX Triple Quad™ 4500 質(zhì)譜系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定梨中的葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇四種糖, 實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好。

實(shí)驗(yàn)思路 1. 配制果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)試四種水溶性糖的低檢出限； 2. 測(cè)試碭山酥梨果實(shí)中四種水溶性糖的含量，了解梨中四種糖的比例關(guān)系。

樣品處理 1．移取果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇標(biāo)準(zhǔn)品，用純水稀釋，配制成 50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 µg/mL、5 µg/mL 和 10 µg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2．梨果實(shí)中可溶性糖的提取。

梨果實(shí)中糖的提取材料：碭山酥梨（采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦園藝實(shí)驗(yàn)站）將樣品去皮削成小塊，液氮速凍后儲(chǔ)存于-80冰箱。稱取2g樣品，加液氮研磨后，加入80%乙醇7 mL混勻。在37℃水浴中恒溫 30 min，超聲提取15 min，10000 r/min離心15 min。將上清液移入25 mL容量瓶。重復(fù)提取3次，后加入80%乙醇定容至25 mL。取2 mL溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用1 mL水溶解蒸干后的固體，溶解時(shí)用超聲波處理，盡量溶解*。溶液離心后，用0.22 µm水系濾膜處理，即可用于測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)此前處理過程提取出的糖樣品在液質(zhì)儀器上的響應(yīng)信號(hào)過高，終樣品又用純水稀釋10倍和1000倍分別上機(jī)測(cè)試。

色譜方法色譜柱：Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm；流動(dòng)相：100%純水洗脫流速：1 mL/min； 柱溫：85℃；進(jìn)樣量：10 µL

質(zhì)譜方法 SCIEX Triple Quad™ 4500 質(zhì)譜系統(tǒng) 掃描方式：MRM采集方式離子源：APCI Negative 離子源參數(shù) CUR：氣簾氣 25.00 psi NC：離子化電流 -2.00 uA TEM：加熱溫度 400.00 ℃ GS1：噴霧氣 75psi CAD：碰撞氣 Medium

掃描方式：MRM采集方式離子源：APCI Negative 離子源參數(shù) CUR：氣簾氣 25.00 psi NC：離子化電流 -2.00 uA TEM：加熱溫度 400.00 ℃ GS1：噴霧氣 75psi CAD：碰撞氣 Medium

結(jié)果與討論 ：1、色譜條件的選擇本實(shí)驗(yàn)選擇使用液相糖分析柱Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm， 1 mL/min 純水流動(dòng)相，對(duì)果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四種糖進(jìn)行分離，其中果糖和葡萄糖為同分異構(gòu)體，用該色譜柱可以得到很好的分離，每種化合物的峰形都很對(duì)稱，峰形較

3、樣品提取條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)中樣品提取過程基于以前使用液相檢測(cè)時(shí)的靈敏度而開發(fā)，因此在用80%乙醇水對(duì)樣品提取之后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)再用純水復(fù)溶的過程將80%乙醇水溶劑替換成純水。而采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)方法檢測(cè)靈敏度比液相提高1000倍以上，樣品濃度無需過高，因此在原有的提取步驟之后，只需用純水將樣品稀釋10倍以上，過濾膜即可上機(jī)測(cè)試。既可以降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)，又大大縮短了樣品前處理所需時(shí)間。

  ……

總結(jié)：本實(shí)驗(yàn)通過SCIEX LC-MS/MS技術(shù)同時(shí)檢測(cè)了果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四種可溶性糖，實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了不同的色譜柱對(duì)靈敏度的影響，終選擇了HPLC糖柱來分析。利用了SCIEX Turbo V™ 離子源強(qiáng)大的耐高流速的特點(diǎn)，在SCIEX Triple Quad™ 4500系統(tǒng)上直接使用了HPLC色譜條件，100%純水1mL/min流速下做液質(zhì)分析，依然得到了良好的檢測(cè)靈敏度。方法的定量限≤50ng/mL。以碭山酥梨為樣品進(jìn)行了可溶性糖的提取前處理，用該液質(zhì)方法進(jìn)行糖含量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)過不同時(shí)間的栽培處理梨中糖分含量差異很大，以含糖量高時(shí)的梨樣品為例，推算出此時(shí)1個(gè)梨果實(shí)中約含果糖12g、葡萄糖7g、蔗糖7g、山梨醇32g。 SCIEX LC-MS/MS系統(tǒng)具有穩(wěn)定耐用易維護(hù)，靈敏度高和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，Turbo V™離子源技術(shù)使質(zhì)譜檢測(cè)耐受不同的液相流速，方法建立和開發(fā)更加簡(jiǎn)便，即使是HPLC的高流速純水方法依然能夠得到很好的檢測(cè)效果。