摘要 ：本文基于固相微萃取和氣相色譜質(zhì)譜 (SPME-GC/MS) 非靶向測(cè)定蜂蜜中揮發(fā)性組分， 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立了不同植物來源蜂蜜判別和預(yù)測(cè)的方法。利用 SPME-GC/MS 對(duì)來自四種植物來源（包括洋槐蜜、椴樹蜜、荊條蜜和油菜蜜）的 87 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣 品中的全譜揮發(fā)性化合物進(jìn)行非靶向分析。通過主成分分析 (PCA) 對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)量控 制。然后，建立基于偏小二乘判別分析 (PLS-DA)、樸素貝葉斯 (NB) 和誤差反向傳 播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (BP-ANN) 的樣品分類預(yù)測(cè)模型。模型的準(zhǔn)確率為 100%，這表明不 同植物來源蜂蜜可以準(zhǔn)確分類。此外，還通過另外一組獨(dú)立的 20 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣品， 對(duì)模型的可靠性和實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證。所有 20 個(gè)樣品均得到準(zhǔn)確分類。后，對(duì)椴 樹蜜的特征揮發(fā)性化合物進(jìn)行初步鑒定。這表明，本研究建立的不同植物來源蜂蜜 判別方法是準(zhǔn)確、可靠的，同時(shí)有助于尋找蜂蜜中的特征化合物。

前言： 蜂蜜以其營養(yǎng)和藥用特性成為了世界上受歡迎的天然產(chǎn)物之一。蜂蜜的植物來源 和產(chǎn)地受到消費(fèi)者的日益關(guān)注。蜂蜜的價(jià) 格通常與其植物來源/產(chǎn)地有關(guān)。因此， 很有必要開發(fā)一種快速強(qiáng)大的方法來鑒定 不同來源的蜂蜜。GC/MS 在識(shí)別和定量 分析復(fù)雜樣品中的有機(jī)化合物方面具有優(yōu) 勢(shì)，與固相微萃取 (SPME) 的組合可用于 分析蜂蜜中的揮發(fā)性化合物[1]。 本應(yīng)用簡報(bào)介紹了近發(fā)表的一項(xiàng)關(guān)于非 靶向揮發(fā)性化合物圖譜的研究[2]，該研究 結(jié)合使用 SPME 和 GC/MS 與化學(xué)計(jì)量學(xué) 方法，對(duì)中國蜂蜜的植物來源進(jìn)行分類。 該研究開發(fā)出一種基于非特異性揮發(fā)性化 合物指紋圖譜和多變量分析分類并預(yù)測(cè)蜂 蜜植物來源的方法。應(yīng)用 SPME-GC/MS 在全掃描模式下非靶向采集蜂蜜的全譜揮 發(fā)性化合物數(shù)據(jù)。使用各種過濾參數(shù)進(jìn)行 多變量優(yōu)化。然后，建立基于偏小二乘 判別分析 (PLS-DA)、樸素貝葉斯 (NB) 和 誤差反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (BP-ANN) 的 預(yù)測(cè)模型。對(duì)于具有顯著性差異的 化合物進(jìn)行了初步確認(rèn)

材料與方法 ：蜂蜜樣品 87 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣品，包括 19 個(gè)洋槐 (Robiniapseudoacacia L.) 蜜樣品、22 個(gè) 椴樹 (Tilia amurensis Rupr.) 蜜樣品、 22 個(gè)荊條 (Vitexnegundo var. heterophyllaRehd.) 蜜樣品和 24 個(gè)油菜 (Brassica campestris L.) 蜜樣品，分別采 集自中國北京、吉林、河北和陜西。從養(yǎng) 蜂人處直接采集 500 g 以上的各種蜂蜜樣 品，并保存在 4 °C 的冰箱中待分析。 固相微萃取 使用 CTC 自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和 2 cm 涂有 50/30 µm 二乙烯苯/Carboxen/聚二甲 基硅氧烷 (DVB/CAR/PDMS) 的纖維頭 （部件號(hào) SU57348U）運(yùn)行 SPME 程序。 分析前，將纖維置于氣相色譜進(jìn)樣口中， 在 270 °C 下老化 1 小時(shí)。SPME 條件如 下：將 3 g 蜂蜜放入包含 1.5 mL 去離子 水和 0.5 g 氯化鈉的 20 mL 頂空螺紋口樣 品瓶（部件號(hào) 5183-4474）中，并用聚四 氟乙烯 (PTFE)/硅橡膠隔墊（部件號(hào) 5183- 4477）將樣品瓶密封。然后在 80 °C 下， 將涂有 DVB/CAR/PDMS 的纖維頭置于樣 品溶液的頂部空氣中暴露 30 分鐘。完成 萃取步驟后，將纖維頭從樣品瓶中取出并 插入氣相色譜進(jìn)樣口中，在 250 °C 下進(jìn) 行 2 分鐘熱脫附。 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 利用 Agilent MassHunter GC/MS 轉(zhuǎn)換軟 件 B.07.00 版將 Agilent ChemStation 數(shù) 據(jù)轉(zhuǎn)換為 MassHunter 數(shù)據(jù)。將轉(zhuǎn)換后的 GC/MS 數(shù)據(jù)導(dǎo)入 MassHunter 未知物分析 軟件（B.07.01 版）中，并根據(jù)未知物分 析的優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行解卷積和鑒定。將處理 后的蜂蜜樣品輪廓圖導(dǎo)出為 cef 文件，然 后導(dǎo)入 Agilent Mass Profiler Professional （13.0 版）中。 采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，例如主成分分析 (PCA)、單因素方差分析 (ANOVA) 和預(yù)測(cè) 模型（包括 PLS-DA、NB 和 BP-ANN）。 圖 1. 本研究所用的部分蜂蜜樣品 化學(xué)品 己烷（MS 級(jí)）購自 Fisher Scientific（中 國上海）。正己烷購自 Sigma-Aldrich，并 采用一系列烷烴 (C8H18–C25H52) 計(jì)算保留 指數(shù)。利用癸酸甲酯 (Sigma-Aldrich) 作 為內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)用水產(chǎn)自 Milli-Q 水純化系 統(tǒng) (Millipore, Bedford, MA, US


結(jié)果與討論： 數(shù)據(jù)挖掘 使用 Agilent MPP 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和化 學(xué)計(jì)量學(xué)分析。對(duì)所有 cef 文件進(jìn)行數(shù)據(jù) 過濾。對(duì)于四組樣品，通過數(shù)據(jù)匹配總共 獲得了 2734 個(gè)化合物。根據(jù) MPP 工作 流程，第yi個(gè)過濾器是按標(biāo)記進(jìn)行過濾， 該步驟用于消除不可靠的化合物。根據(jù) 各個(gè)樣品是否高于閾值或達(dá)到飽和設(shè)置 “存在”和“臨界”標(biāo)志，以從整個(gè)數(shù)據(jù) 集中過濾化合物。保留了 87 個(gè)樣品中至 少 2 個(gè)樣品中可接受的化合物。第二個(gè) 過濾器是按頻率過濾，根據(jù)化合物在樣 品中的出現(xiàn)頻率對(duì)其進(jìn)行過濾。在該步 驟中，必須是存在的化合物才可進(jìn)行該 步過濾。這些過濾條件保留了每個(gè)樣品 中在至少一種條件中出現(xiàn)的化合物。第 三個(gè)過濾器是顯著性分析，根據(jù)單因素 方差分析計(jì)算出的 p 值。為確保僅保留 存在顯著差異的化合物，在大多數(shù)情況 下，選擇的 p 值截止值為 0.05。經(jīng)過三 個(gè)過濾步驟，將化合物數(shù)量從 2734 減少 至 114。為鑒定處理樣品和對(duì)照樣品之間 的豐度比或差異超出給定倍數(shù)變化截止值 或閾值的化合物，采用倍數(shù)變化分析作 為終過濾步驟。當(dāng)倍數(shù)變化截止值為 2 時(shí)，保留了 110 個(gè)化合物，表明一系列 過濾步驟顯著減少了變量數(shù)量和數(shù)據(jù)集的 維數(shù)。


主成分分析 PCA 是常用的無監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)方法，可 以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，消除眾多復(fù)雜 信息中重疊的部分，盡可能地用少數(shù)變 量來解釋數(shù)據(jù)中的大部分信息。根據(jù)先 前的過濾結(jié)果，將 PCA 應(yīng)用于四個(gè)植物 來源的 87 個(gè)蜂蜜樣品，以分析其自然分 組。一般而言，如果前四個(gè) PC 能夠解釋總變量的 75%，則認(rèn)為模型是準(zhǔn)確可靠 的。[3] 有必要進(jìn)一步選擇并減少前文提及 的變量，從而提高模型的可靠性。倍數(shù) 變化截止值可根據(jù)上述過濾步驟進(jìn)行優(yōu) 化。將 PC1-PC4 解釋的總變化視為評(píng)估 標(biāo)準(zhǔn)，選擇的倍數(shù)變化截止值為 200。圖 2 顯示了倍數(shù)變化截止值為 200 的蜂蜜樣 品的得分圖。椴樹蜜樣品位于第yi主成分 (PC1) 的右側(cè)，而其他三種類型的蜂蜜位于 PC1 的左側(cè)。因此，PC1 將蜂蜜樣品 清楚地分為椴樹蜜和非椴樹蜜。椴樹蜜和 油菜蜜樣品均具有正 PC2，而荊條蜜和 洋槐蜜樣品均具有負(fù) PC2。PC1 和 PC2 分別占方差的 35.35% 和 25.38%，且前 四個(gè) PC 占總變量的 79.12%。因此，選 擇 200 作為倍數(shù)變化截至值，同時(shí)將這 70 個(gè)保留下來的化合物作為變量用于模 型建立。

模型建立與預(yù)測(cè) PCA 結(jié)果表明，過濾后的數(shù)據(jù)可用于區(qū)分 蜂蜜樣品的植物來源。以上述 70 個(gè)化合物 為變量，應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立溯源模 型，用于對(duì)各種來源的蜂蜜進(jìn)行分類和預(yù) 測(cè)。本研究基于 87 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣品（包括 19 個(gè)洋槐蜜樣品、22 個(gè)椴樹蜜樣品、 24 個(gè)油菜蜜樣品和 22 個(gè)荊條蜜樣品）建 立了三種分類模型，即 PLS-DA、NB 和 BP-ANN。模型訓(xùn)練和驗(yàn)證過程中正確分 類蜂蜜樣品的百分比證明了這些模型的識(shí) 別和預(yù)測(cè)能力。表 2 列出了這三種模型的 準(zhǔn)確度，100% 的蜂蜜樣品得到準(zhǔn)確分類。 盡管模型訓(xùn)練中的識(shí)別能力和模型交叉 驗(yàn)證中的預(yù)測(cè)能力為 100%，但采用原始 87 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣品中不包括的樣品對(duì)建立 的模型進(jìn)行驗(yàn)證仍然*。因此，將 另外 20 個(gè)未包括在統(tǒng)計(jì)模型開發(fā)過程中的 真實(shí)蜂蜜樣品（包括每種植物來源各 5 個(gè) 蜂蜜樣品）作為測(cè)試集進(jìn)行分析。表 3 列 出了預(yù)測(cè)結(jié)果和置信度。所有 20 個(gè)真實(shí) 蜂蜜樣品均得到正確預(yù)測(cè)。盡管預(yù)測(cè)組 與實(shí)際組一致，但對(duì)于 PLS-DA、NB 和 BP-ANN 模型，置信度的值有所不同。

揮發(fā)性化合物標(biāo)記物的鑒定 利用維恩圖對(duì)不同植物來源蜂蜜在預(yù)測(cè)模 型中的化合物列表進(jìn)行確認(rèn)。圖 3 顯示了 各種植物來源的化合物列表和交叉情況。 洋槐蜜、荊條蜜、椴樹蜜和油菜蜜的化合 物列表分別包含 50、43、52 和 47 個(gè)化 合物。由于椴樹蜜在質(zhì)量和價(jià)格上均優(yōu)于 其他蜂蜜，因此標(biāo)記物鑒定的重點(diǎn)放在 在椴樹蜜樣品中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性化合物。 圖 3 顯示了初步選擇的僅出現(xiàn)在椴樹蜜 中的八種揮發(fā)性化合物。通過 NIST 對(duì)它 們進(jìn)行初步鑒定。表 4 列出了它們的保 留時(shí)間、保留指數(shù)、離子和參考文獻(xiàn)。 除戊酸、2-甲酸酐外，椴樹蜜中的所有 其他化合物均在參考文獻(xiàn)中有報(bào)道[5-8]。 其中，Blank 等人提出將順式玫瑰醚作為 椴樹蜜的指示劑[6]。Blank 還從椴樹 (Tilia cordata) 花中發(fā)現(xiàn)了這種化合物，但在其 他類型的蜂蜜中并未發(fā)現(xiàn)[6]。盡管缺少有 關(guān)椴樹花中揮發(fā)性化合物的文獻(xiàn)報(bào)道，但 表 4 列出的化合物也被初步視為椴樹蜜 的標(biāo)記化合物。這些化合物在區(qū)分椴樹蜜 與其他蜂蜜方面有重要意義。

結(jié)論 本研究成功應(yīng)用了基于 SPME 和非靶 向 GC/MS 分析與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合的 分類方法來區(qū)分各種植物來源的蜂蜜樣 品。基于 87 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣品建立了三種 分類模型，即 PLS-DA、NB 和 BP-ANN， 模型準(zhǔn)確度為 100%。另外 20 個(gè)真實(shí)蜂 蜜樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，所開發(fā)的模型實(shí) 用而可靠。因此，SPME-GC/MS 測(cè)定非 特異性輪廓結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法在不同植 物來源分類和判別方面具有廣闊的應(yīng)用 前景。