使用LC-MS/MS系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)酰胺和己糖基神經(jīng)酰胺進(jìn)行高通量靶向篩查
應(yīng)用優(yōu)勢(shì) ■ 快速定量血漿和血清中的24種神經(jīng)酰胺、 23種己糖基神經(jīng)酰胺以及鞘氨醇 ■ 使用Quanpedia™和SOP構(gòu)建性能穩(wěn)定、便于部署的平臺(tái),降低方法開發(fā)和培訓(xùn)成本 ■ 使用TargetLynx™軟件和第三方信息學(xué)軟件(即Skyline)實(shí)現(xiàn)快速數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)可視化 ■ 比同類工作流程更快、更經(jīng)濟(jì)
簡(jiǎn)介鞘脂(SLs)是脂質(zhì)中的一類,包括神經(jīng)酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)和較為復(fù)雜的鞘糖脂。所有SLs都有一條“長(zhǎng)鏈”,也就是鞘氨醇?jí)A基鏈1 。這些堿基是鞘氨醇(SPH)等有機(jī)脂肪族氨基醇或者結(jié)構(gòu)相似化合物(圖1)。這些化合物是細(xì)胞膜的重要組成部分,與多種生物功能有關(guān),包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡2,3。SLs在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、研究化療耐藥機(jī)制方面起著關(guān)鍵的作用4 ,另外已有研究發(fā)現(xiàn),帕金森患者體內(nèi)的神經(jīng)酰胺(Cer)和己糖基神經(jīng)酰胺(HexCer)含量偏高5 。 SLs代謝轉(zhuǎn)化快、代謝物種類繁多且功能相似,給單獨(dú)研究某一種鞘脂的功能帶來了很大難度。
雖然質(zhì)譜(MS)技術(shù)的進(jìn)步讓研究人員得以進(jìn)行更深入的脂質(zhì)組學(xué)分析,但鑒定和定量分析依然比較困難。脂質(zhì)有大量的同分異構(gòu)和同量異位物質(zhì)。此外,MS譜圖中通常有多種化合物的峰和碎片,要想對(duì)特定的分子進(jìn)行明確鑒定和相對(duì)定量,不僅難度大,而且極為耗時(shí)。這嚴(yán)重阻礙了實(shí)驗(yàn)室之間的脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)傳遞,導(dǎo)致研究人員難以通過多地點(diǎn)研究得出生物學(xué)解釋。本研究使用基于親水作用色譜(HILIC)的方法分離不同類別的脂質(zhì),然后使用MS進(jìn)行檢測(cè),從而降低了鑒定結(jié)果的不確定性6 。按照?qǐng)D2. 大多數(shù)研究實(shí)驗(yàn)室的通用脂質(zhì)組學(xué)工作流程,圖中突出顯示了LipidQuan工作流程。類別分離不同的脂質(zhì)還可以減少定量分析所需的穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SIL)標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)而降低成本。本應(yīng)用紀(jì)要介紹了在LipidQuan平臺(tái)(圖2)上運(yùn)行基于HILIC的方法對(duì)Cer、HexCer、SPH進(jìn)行的靶向篩查。
實(shí)驗(yàn):樣品向混合的健康人血漿中添加穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SIL)的SLs(氘代CERAMIDE LIPIDOMIX™,Avanti Lipids,美國(guó)亞拉巴馬州阿拉巴斯特),制備九個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品用于繪制定量用標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析物的濃度范圍如下:C16神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0) = 2.2-1090 ng/mL、C18神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)= 1.2-575 ng/mL、C24神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0) =2.6-1315 ng/mL、C24:1神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1) = 1.3-665 ng/mL。另外,通過萃取前加標(biāo)的方式向NIST標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)® 1950血漿中(Sigma Aldrich,英國(guó)普爾)添加5% SIL,制備6個(gè)重復(fù)樣。樣品制備樣品制備方案很簡(jiǎn)單,使用預(yù)冷的異丙醇(IPA)沉淀蛋白(1:5,血漿:IPA)即可。將樣品渦旋混合1 min,在-20 °C下放置10 min。接著再將樣品渦旋混合1 min,然后在4 °C下放置2 h,確保蛋白沉淀*。將萃取的樣品在4 °C下離心10 min(大離心力10,300 g),然后將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃樣品瓶,進(jìn)行LC-MS/MS分析。
實(shí)驗(yàn) LC條件 LC系統(tǒng): ACQUITY UPLC I-Class液相色譜系統(tǒng)固定定量環(huán)(FL)或流通針式(FTN) 色譜柱: ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1 × 100 mm, 1.7 µm 柱溫: 45 °C 流速: 0.6 mL/min 流動(dòng)相A: 95:5乙腈/水 +10 mM醋酸銨流動(dòng)相B: 50:50乙腈/水 +10 mM醋酸銨梯度: 流動(dòng)相B在2 min內(nèi)從0.1%升至20.0%,然后在3 min內(nèi)從20%升至80%,隨后重新平衡3 min 運(yùn)行時(shí)間: 8 min 進(jìn)樣體積: 1 µL MS條件 MS系統(tǒng): Xevo TQ-S micro、Xevo TQ-XS和Xevo TQ-S 電離模式: ESI (+) 毛細(xì)管電壓: 2.8 kV (+) 采集模式: MRM 離子源溫度: 120 °C 脫溶劑氣溫度: 500 °C 錐孔氣流速: 150 L/h 脫溶劑氣流速: 1000 L/h 霧化氣: 7 bar 離子導(dǎo)入裝置偏移1: 3 V 離子導(dǎo)入裝置偏移2: 0.3 V
信息學(xué)軟件創(chuàng)建LipidQuan Quanpedia方法文件(1.4版),其中包含LC條件、MS方法以及相關(guān)的TargetLynx處理方法(包括保留時(shí)間和 MRM通道)。使用TargetLynx或Skyline(華盛頓大學(xué)MacCoss 實(shí)驗(yàn)室軟件)處理所得數(shù)據(jù)。
結(jié)果與討論 LipidQuan使用正離子模式MRM對(duì)人血漿中的Cer和HexCer類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量,同時(shí)還能分析其它脂類,如TG、PC、 SM。在HILIC分離條件下,Cer在溶劑前沿洗脫(大約0.4 min 處),HexCer和SPH類脂質(zhì)洗脫為分離的峰(大約0.8-1.1 min 處),如圖3所示??偣卜治隽?4種Cer、23種HexCer和SPH。得益于該方法的靈敏度,使用50 µL血漿可輕松檢測(cè)出人血漿中正常循環(huán)水平的這些脂質(zhì),其線性動(dòng)態(tài)范圍覆蓋4個(gè)數(shù)量級(jí)。此處討論的Cer和HexCer脂質(zhì)通道使用的是脂質(zhì)母離子及其特征長(zhǎng)鏈堿基(LCB)子離子(m/z 264)(圖1)。通道列表見表1和表2。使用萃取前加標(biāo)已知濃度SIL標(biāo)準(zhǔn)品的血漿樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量分析。采用相同條件制備和分析內(nèi)源性脂質(zhì)的替代標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)同類內(nèi)源性脂質(zhì)進(jìn)行了定量分析。使用市售的預(yù)混合SIL 溶液而非每種待測(cè)脂質(zhì)的SIL,可以顯著降低大規(guī)模研究的總體成本。SIL標(biāo)準(zhǔn)品C16神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0)、C18神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)和C24神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0)的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例如圖4所示,可用于定量?jī)?nèi)源性的Cer和HexCer。使用氘代CERAMIDE LIPIDOMIX SIL標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),若典型R2 值> 0.95,且與擬合直線的偏差(CV) < 30%,則視為標(biāo)準(zhǔn)曲線可接受。C24:1神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線不符合此標(biāo)準(zhǔn)。由于事先已開發(fā)好LipidQuan Quanpedia方法文件,用戶只需下載用于分析Cer和HexCer脂質(zhì)類別的MRM通道和色譜條件即可,無需手動(dòng)輸入LC-MS方法,因此避免了可能出現(xiàn)的抄錄錯(cuò)誤
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