5分鐘拉近你與科學(xué)前沿的距離，一起來(lái)了解“FAMIN蛋白對(duì)嘌呤核苷酸代謝的影響”

由LACC1編碼的FAMIN（Fatty Acid Metabolism-Immunity Nexus）是一種和許多疾病相關(guān)的蛋白，高外顯率突變，如C284R或I254V，可導(dǎo)致幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎（JIA），成人Still綜合癥，麻風(fēng)病或早發(fā)炎癥性腸病等。小鼠的基因敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示FAMIN活性降低會(huì)加重?cái)⊙Y和關(guān)節(jié)炎的程度，另有研究顯示FAMIN會(huì)對(duì)線粒體功能的正常發(fā)揮和巨噬細(xì)胞的氧化磷酸化及糖酵解都產(chǎn)生影響。

英國(guó)阿登布魯克醫(yī)院和劍橋大學(xué)在相關(guān)方面做了一個(gè)多組學(xué)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)并將結(jié)果總結(jié)發(fā)表在Cell雜志上，旨在研究FAMIN作為一個(gè)多功能嘌呤核苷酸代謝酶的作用，實(shí)驗(yàn)從不同角度，利用不同平臺(tái)研究了嘌呤核苷酸的代謝及其對(duì)線粒體功能的影響。

圖：嘌呤核苷酸代謝通路

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現(xiàn)就代謝組學(xué)的部分進(jìn)行詳細(xì)介紹：

首先 …

將HepG2細(xì)胞進(jìn)行FAMIN siRNA轉(zhuǎn)染，并對(duì)細(xì)胞數(shù)目和耗氧量等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在FAMINyi制后，細(xì)胞增殖減少，糖酵解和氧化磷酸化的速度都有不同程度的下降。將FAMINyi制的 HepG2細(xì)胞分別和10ug重組人FAMIN254I或等量蛋白緩沖液（空白對(duì)照）在37℃的PBS中孵育1hr，將樣本中的小分子代謝物用甲醇提取并進(jìn)行LCMS分析，得到超過(guò)25,000個(gè)特征峰。

圖：正離子和負(fù)離子模式下檢測(cè)到的離子m/z和豐度

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LCMS實(shí)驗(yàn)在Vanquish+Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)上進(jìn)行，對(duì)于極性較高的水相代謝物，采用HILIC色譜柱進(jìn)行液相分離，Orbitrap質(zhì)譜的分辨率設(shè)置為70,000，wan美分辨復(fù)雜的體系，同時(shí)高質(zhì)量精度的數(shù)據(jù)確保在化學(xué)式匹配和化合物檢索的時(shí)候得到準(zhǔn)確結(jié)果，zui大程度上減少了假陽(yáng)性或假陰性情況的發(fā)生。

對(duì)比FAMIN254I孵育的樣本和空白對(duì)照，發(fā)現(xiàn)FAMIN254I孵育的提取物中3個(gè)特征峰有明顯降低，4個(gè)升高，就像下面這張火山圖展示的一樣。

確定這7個(gè)生物標(biāo)志物的步驟如下：

在鑒定的過(guò)程中，首先需要確定生物標(biāo)志物的化學(xué)式，對(duì)于Orbitrap的數(shù)據(jù)來(lái)講，這一步是通過(guò)精確質(zhì)荷比和同位素精細(xì)結(jié)構(gòu)結(jié)合來(lái)完成的（質(zhì)量偏差不超過(guò)2ppm）；

然后將化學(xué)式同二級(jí)質(zhì)譜信息結(jié)合，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，得到化合物的結(jié)構(gòu)信息，下圖以adenosine為例，上半部分是實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)中的二級(jí)質(zhì)譜圖，下半部分是mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)里的信息，二者以鏡像圖的形式展示，清楚地體現(xiàn)了實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫(kù)信息的匹配程度，并將匹配到的碎片結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)注。

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此處檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)為mzCloud（https://www.mzcloud。。ｏｒｇ/），mzCloud是規(guī)模龐大、信息豐富的高分辨譜圖庫(kù)，現(xiàn)包含超過(guò)18,500個(gè)化合物，并且這個(gè)數(shù)量還在不停增加，譜圖的數(shù)量超過(guò)725萬(wàn)張，包括不同碎裂方式和碰撞能的信息，所有譜圖全部為標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)，是化合物鑒定的重要支持。

圖：mzCloud界面展示

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對(duì)于如此龐大的特征峰數(shù)量和理化性質(zhì)各異的代謝物，實(shí)驗(yàn)者手動(dòng)鑒定豈不是要做到頭禿，不要擔(dān)心，有強(qiáng)大的軟件幫助我們自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。這個(gè)軟件就是高分辨液質(zhì)數(shù)據(jù)處理的利器——Compound Discoverer。

Compound Discoverer …

Compound Discoverer軟件可以完成從原始數(shù)據(jù)到zui終結(jié)果的全流程工作，包括特征峰提取和對(duì)齊、化學(xué)式預(yù)測(cè)、化合物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝通路分析，以及代謝組學(xué)常用的主成分分析（PCA）、偏小二乘方判別分析（PLS-DA）等，結(jié)果的呈現(xiàn)形式包括散點(diǎn)圖、火山圖、柱狀圖、箱式圖、熱圖等，如果這些還不能滿(mǎn)足你，別擔(dān)心，用戶(hù)還可以自編程將數(shù)據(jù)按照自己想要的方式展示或計(jì)算。

圖：Compound Discoverer結(jié)果展示示例（左→右：PCA散點(diǎn)圖、火山圖，S-plot，熱圖）

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本研究通過(guò)Compound Discoverer軟件的自動(dòng)峰提取、對(duì)齊和鑒定，得到差異代謝物a-c分別是adenosine、inosine和guanosine，為了進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，將樣本中三個(gè)化合物的提取離子流圖同標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，得到*一致的色譜保留行為，故確定幾個(gè)化合物鑒定的準(zhǔn)確度，下圖展示了化合物a和b 分別同adenosine和inosine標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)匹配的情況。

同樣的過(guò)程，對(duì)含量相對(duì)升高的化合物d-g進(jìn)行鑒定，得到結(jié)果分別為hypoxanthine，guanine，pentose-phosphate, xanthine。至于究竟是哪種pentose-phosphate，同樣采用同標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰比對(duì)的方法，并且采用TSQ Quantiva的SRM碎片比例來(lái)驗(yàn)證，確定結(jié)果為R1P，如下圖。

差異代謝物a-c在兩組的峰面積在FAMIN254I組中有所降低，提示FAMIN可以分解胞內(nèi)嘌呤核苷。

同時(shí)，化合物d-f在FAMIN254I存在的情況下含量有所升高（g的量太低，不做展示），提示FAMIN在幫助核堿基和R1P合成。

化合物a-c均隨重組FAMIN254I的劑量增加而峰面積降低，而其它核苷酸或核苷并未受FAMIN254I影響，提示FAMIN是作用于嘌呤核苷，將其生成對(duì)應(yīng)的核堿基和R1P的酶。

在擬靶向代謝組學(xué)的工作中，三重四極桿和Orbitrap高分辨質(zhì)譜相結(jié)合，可以提供豐富的數(shù)據(jù)覆蓋廣度和超高的定量能力，本研究中采用TSQ Quantiva和Q Exactive Plus相結(jié)合，定位到同F(xiàn)AMIN作用相關(guān)的代謝物及其通路。在今年的ASMS，賽默飛推出了新一代Orbitrap Exploris 240，自帶多種方法模板，同TSQ平臺(tái)輕松進(jìn)行方法無(wú)縫轉(zhuǎn)換，操作簡(jiǎn)便，結(jié)合AcquireX功能，助力擬靶向代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)，將研究的覆蓋廣度和數(shù)據(jù)挖掘深度做到j(luò)i致，有興趣的老師請(qǐng)掃描以下二維碼獲得電子樣本。

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