摘要：本應(yīng)用簡報(bào)介紹了使用 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色譜與配備 ESI 離子源的 Agilent Ultivo 三重四極桿 LC/MS 聯(lián)用系統(tǒng)對褪黑素 (MEL) 進(jìn)行的定量研究。對于加標(biāo)至血漿中的褪黑素-D4 (MEL-D4)，經(jīng)優(yōu)化的 LC/MS 方法獲得了 10 pg/mL 的定量下限 (LLOQ)。這種高靈敏度的快速研究方法可以定量分析通過簡單的蛋白質(zhì)沉淀方法前處理的復(fù)雜人血漿提取物中的低濃度內(nèi)源性 MEL。

前言 ：MEL 是一種內(nèi)源性激素和強(qiáng)效的神經(jīng)遞質(zhì)，幫助調(diào)節(jié)生理節(jié)律和睡眠，通常用于治療失眠等睡眠障礙。有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)和內(nèi)源性 MEL 產(chǎn)生的研究需要能夠測量低分布濃度的 MEL 的分析技術(shù)，該濃度隨個(gè)體和一天中時(shí)間的變化而變化。由于 LC/MS/MS 方法比傳統(tǒng)的放射免疫分析具有更高的特異性，該方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)開發(fā)了 LC/MS/MS 方法以滿足對血漿中 MEL 進(jìn)行高靈敏度和高特異性定量的生物分析要求。本應(yīng)用簡報(bào)表明 1260 Infinity II Prime 液相色譜與配備 ESI 離子源的 Ultivo LC/TQ 的聯(lián)用系統(tǒng)可獲得精確定量人血漿中的 MEL 所需的分析靈敏度。

實(shí)驗(yàn)部分：試劑與化學(xué)品所有試劑和溶劑均為 HPLC 或 LC/MS 級。乙腈和甲醇購自 Honeywell (Morristown, NJ, USA)。超純水產(chǎn)自配備 LC - Pa k Polisher 和 0.22 µm 膜式終端過濾器濾芯的 Milli-Q Integral 系統(tǒng) (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。LC/MS 級甲酸購自 Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA)。氟化銨和 LC/MS 級甲酸銨購自 Millipore Sigma (St. Louis, MO, USA)。MEL (≥ 98%) 和 MEL-D4（≥ 98% MEL，≥ 99% 氘代形式 D1–D4）購自 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)。NIST SRM 1950 人血漿購自 Millipore Sigma。檸檬酸鹽人血漿也購自 Millipore Sigma，僅用于回收率研究。對于血漿中 MEL-D4 的 LLOQ 測定，采用血漿提取物配制 13 個(gè)校準(zhǔn)濃度，濃度范圍為 10 pg/mL 至 100 ng/mL。根據(jù)制造商對氘代 MEL (D1–D4) 的建議，首先通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)的定量離子對（237.1 & 178.1 與 233.1 & 174.1）峰強(qiáng)度比，根據(jù)精確量的未標(biāo)記 MEL 對此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備混合液進(jìn)行定量。我們并未在 MEL-D4 中觀察到大量的 D0 形式。在純?nèi)軇┲蟹治?100 ng/mL MEL-D4 時(shí)沒有明顯的未標(biāo)記 MEL MRM 信號(hào) (< 0.1%) 可以證明這一點(diǎn)。

樣品前處理：對于所有實(shí)驗(yàn)，血漿的蛋白質(zhì)沉淀步驟如下：將 EDTA (0.5 mol/L, 50 µL) 加入到 200 µL 于冰上保存的血漿等分試樣中，短暫渦旋混合。加入乙腈 (750 µL)，渦旋 30 秒，在冰上孵育 20 分鐘，然后在 4 °C 下以 16000 × g 的速度離心 10 分鐘以沉淀蛋白質(zhì)。將有機(jī)上清液 (800 µL) 轉(zhuǎn)移至 2 mL 棕色 LC/MS 樣品瓶中，利用真空濃縮儀對其進(jìn)行干燥。將提取物復(fù)溶于 100 µL 甲醇，超聲水浴處理 5 分鐘，然后轉(zhuǎn)移至 250 µL 玻璃自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶內(nèi)插管中，用于 LC/MS 分析。此外，需使用重組血漿配制校準(zhǔn)曲線樣品。 MEL 是一種光敏化合物，注意盡量減少光照。對于回收率評估，在提取之前（預(yù)加標(biāo)），向四個(gè)血漿重復(fù)試樣中加標(biāo) MT-D4，加標(biāo)濃度為 1 ng/mL。將上述重復(fù)試樣與后加標(biāo)的四個(gè)血漿重復(fù)試樣進(jìn)行比較，計(jì)算回收率。為了測定內(nèi)源性 MEL，向一份血漿等分試樣中預(yù)加標(biāo) MT-D4，加標(biāo)濃度為 10 ng/mL，以校正樣品前處理中的損失，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

儀器： Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色譜儀： • Agilent 1260 Infinity II Prime 全能泵 (G7104C) • Agilent 1260 Infinity II Multisampler，配備冷卻裝置 (G7167A) • Agilent 1260 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116A) • Agilent Ultivo 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) • 安捷倫電噴霧離子源 (G1948B)

結(jié)論：本應(yīng)用簡報(bào)證明 Ultivo-ESI 具有與標(biāo)準(zhǔn) Ultivo 系統(tǒng)相媲美的出色性能。它實(shí)現(xiàn)了定量研究血漿中低 ppt 級褪黑素所需的分析靈敏度。此系統(tǒng)也是一款經(jīng)濟(jì)適用的儀器，能夠定量血漿中低濃度的內(nèi)源性褪黑素，并且僅需極少的樣品前處理。