在往期分享中，我們介紹了IVIS成像系統(tǒng)在動(dòng)物水平的眾多應(yīng)用，其實(shí)IVIS同樣可以用于全植物成像。此次我們就分享IVIS在水稻氮代謝研究中的應(yīng)用。

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的養(yǎng)分，但其在土壤中的濃度往往達(dá)不到佳作物生長(zhǎng)濃度。因此，提高作物氮素利用率被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的一個(gè)主要目標(biāo)。然而，關(guān)于作物氮代謝仍有許多需要了解的地方。

在此，研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)分子傳感器系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)水稻中氮的狀態(tài)，該方法發(fā)表在《Frontiers in Plant Science》雜志上。研究中首先利用該系統(tǒng)研究了尿囊素的作用，尿囊素分解為尿囊素衍生的代謝物，在低濃度下作為氮源使用。參與尿素代謝的兩個(gè)基因尿囊素酶(OsALN)和尿素滲透酶1 (OsUPS1)，對(duì)氮狀態(tài)高度敏感，在低氮條件下，OsALN迅速上調(diào)，而高氮條件下OsUPS1表達(dá)上調(diào)。基于上述機(jī)制，研究人員培育了含有氮分子傳感器系統(tǒng)的[proALN::ALN-LUC2]和[proUPS1::UPS1-LUC2]轉(zhuǎn)基因水稻。這種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以模擬內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，即OsALN和OsUPS1基因?qū)ν庠碞狀態(tài)的響應(yīng)。

文中使用兩種方法來(lái)測(cè)定分子氮傳感器的能力：

方法一：在長(zhǎng)期培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)基因水稻植株在高濃度氮源培養(yǎng)基(GM+N)或不含氮源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM-N)中培養(yǎng)5天，隨后使用IVIS活體成像系統(tǒng)進(jìn)行成像及定量。

結(jié)果顯示，生長(zhǎng)在GM+N培養(yǎng)基中的 proUPS1::UPS1-LUC2 水稻植株表現(xiàn)出更高的熒光素酶活性（圖1A）。為了對(duì)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行定量，研究人員測(cè)定了5個(gè)獨(dú)立的純合系（具有單個(gè)基因拷貝）。生長(zhǎng)在GM+N培養(yǎng)基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株發(fā)光信號(hào)強(qiáng)于GM-N組20倍，而強(qiáng)于對(duì)照組約2,800倍（圖1B）。

方法二：在短期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因水稻植株先在GM-N培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，第5天在加入100nM硫酸銨。結(jié)果顯示，同長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣，生長(zhǎng)在后期加 氮培養(yǎng)基中proUPS1::UPS1-LUC2 植株，發(fā)光信號(hào)更強(qiáng)（圖1C）。同樣對(duì)5株獨(dú)立的純合系進(jìn)行了定量，生長(zhǎng)在后期加N培養(yǎng)基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)于GM-N培養(yǎng)基中約50倍，而強(qiáng)于對(duì)照組13,000倍（下圖1D）。

圖1.在高氮培養(yǎng)條件下，proUPS1::UPS1-LUC2 具有很強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)。

(A)對(duì)照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM+N或者GM–N培養(yǎng)基 中培養(yǎng)5天；

(B)5個(gè)獨(dú)立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(A)條件下，發(fā)光定量結(jié)果；

(C)對(duì)照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM–N生長(zhǎng)5天, 或者在GM–N培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4天，然后加入100 mM硝酸銨培養(yǎng)1天；

(D)5個(gè)獨(dú)立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(C)條件下的定量結(jié)果，以對(duì)照組作為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化 。

這些結(jié)果說(shuō)明，proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器能夠通過(guò)發(fā)光信號(hào)水平檢測(cè)外源氮的情況。

同樣在研究中對(duì)proALN::ALN-LUC2 植株進(jìn)行了相同的處理。結(jié)果顯示，在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，GM+N和GM-N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的proALN::ALN-LUC2 沒(méi)有明顯差異（圖2A）。對(duì)5株獨(dú)立的純品系進(jìn)行發(fā)光信號(hào)定量，相比GM+N培養(yǎng)基，GM-N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的proALN::ALN-LUC2 植株發(fā)光信號(hào)要高約1.8倍，比對(duì)照組高約17倍（圖2B）。因此很難鑒定GM+N和GM-N培養(yǎng)基對(duì)生長(zhǎng)的影響。而在短時(shí)間培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)生長(zhǎng)在GM-N培養(yǎng)基中的proALN::ALN-LUC2，發(fā)光信號(hào)要強(qiáng)于加高氮培養(yǎng)1天的。

圖2.在低氮培養(yǎng)條件下，proALN::ALN-LUC2 植株顯示強(qiáng)的生物發(fā)光信號(hào)。

(A)對(duì)照組和proALN::ALN-LUC2 植株，在GM+N or GM–N培養(yǎng)基中培養(yǎng).；

(B)A組相對(duì)定量結(jié)果；

(C)對(duì)照和proALN::ALN-LUC2 植株在 GM–N中培養(yǎng)5天，或者在GM–N培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，然后加入100 mM 硝酸銨再培養(yǎng)1天 ；

(D)C組相對(duì)定量結(jié)果；GM–N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的對(duì)照組植株作為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

此外，在文章中，還利用IVIS活體成像系統(tǒng)，探討了該傳感器對(duì)于氮源是否具有選擇性及對(duì)于氮源的敏感性。結(jié)果顯示proUPS1::UPS1-LUC2 和proALN::ALN-LUC2 對(duì)于氮源無(wú)特異性，可以廣泛的作為水稻等植株中分子氮的傳感器。并且proUPS1: UPS1-LUC2 植株在硝酸銨、硫酸銨或硝酸鉀濃度> 1mM即表現(xiàn)出強(qiáng)烈的生物發(fā)光信號(hào)，而低氮濃度(< 0.01mM)信號(hào)減弱。0.1mM硝酸鉀proUPS1:: UPS1-LUC2 植株誘導(dǎo)強(qiáng)烈的生物發(fā)光信號(hào)，而0.1mM硝酸銨和硫酸銨則沒(méi)有。這表明， proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器監(jiān)測(cè)高氮狀態(tài)，低氮狀態(tài)。proALN::ALNLUC2 在低氮濃度(<0.1 mM)下表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光素酶活性，而在高氮濃度下表現(xiàn)出較弱的活性(> 10mM)。

綜上，分子氮傳感器的信號(hào)反映了分子氮的內(nèi)部狀態(tài)。結(jié)合IVIS活體成像技術(shù)，proALN::ALN-LUC2和proUPS1::UPS1-LUC2 可作為分子傳感器在不同研究中監(jiān)測(cè)大米內(nèi)部氮狀態(tài)。

文獻(xiàn)來(lái)源：Dong-Keun Lee, Mark C. F. R. Redillas, Harin Jung, Seowon Choi, Youn Shic Kim and Ju-Kon Kim. A Nitrogen Molecular Sensing System, Comprised of the ALLANTOINASE and UREIDE PERMEASE 1 Genes, Can Be Used to Monitor N Status in Rice. Front. Plant Sci, 18 April 2018.