【概述】

藥品安全直接關(guān)系人類健康，近年來成為研究熱點。以抗生素類藥物為例，它的使用挽救了無數(shù)人的生命。與此同時,臨床不良反應(yīng)也客觀存在,每年有數(shù)以萬計患者的健康乃至生命與相關(guān)藥源性疾病有關(guān)。這些不良反應(yīng)的發(fā)生除與藥物本身的藥理活性有關(guān)外,與藥品中的雜質(zhì)尤其是毒性雜質(zhì)也有很大關(guān)系。而藥物的生產(chǎn)工藝決定了其雜質(zhì)來源各異、種類眾多、成份復(fù)雜且含量較低?；蚨拘噪s質(zhì)是指直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生致突變和致癌作用的物質(zhì)。常用的縮寫為PGLs和GTLs。可能產(chǎn)生基因毒性雜質(zhì)的環(huán)節(jié)為：

1）新藥合成；

2）原料純化；

3）存儲運輸（與包裝物接觸）等。

有關(guān)基因毒性雜質(zhì)的問題，通常使用相關(guān)指南，如2007年實施的EMEA（歐洲藥品局），該指南為限制新活性物質(zhì)中的基因毒性雜質(zhì)提供了解決問題的框架和具體作法。2008年12月FDA發(fā)布的Guidance for industry---Genotoxicand Carcinogenic Impurities in Drug Substances andProducts:Recommended Approaches.

主要內(nèi)容：1）指南發(fā)布的背景；

2）原料藥和制劑中的基因毒性雜質(zhì)生成的預(yù)防方法；

3）基因毒性雜質(zhì)的分析方法、處理方法和減少方法等；

4）上市申請和臨床研究申請的可接受限度；

5）草藥原料藥和制劑中基因毒性雜質(zhì)的評估指南。

這里有必要引入TTC概念，TCC Threshold of ToxicologicalConcern：毒性物質(zhì)*，也叫做毒理學(xué)關(guān)注門檻。一個未知基因毒性數(shù)據(jù)雜質(zhì)的TTC=1.5微克/天。因此,有必要建立一種高靈敏度、高選擇性的基因毒性雜質(zhì)分析方法。

【實驗/設(shè)備條件】

色譜方法

柱溫箱：50℃（1 min）_10℃/min_220℃_20℃/min_250℃（3 min）；

進(jìn)樣口：不分流進(jìn)樣（1 min），進(jìn)樣口溫度200℃；

載氣流速：1.2 mL/min（恒流）

進(jìn)樣體積：1.0 µL

質(zhì)譜方法

傳輸線溫度：250℃；

離子源溫度：300℃

掃描方式：定時掃描-SRM模式（Timed-SRM）

【實驗/操作方法】

越來越多的藥企及相關(guān)機構(gòu)開始采用串接質(zhì)譜技術(shù)解決此問題。本文應(yīng)用賽默飛三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀TSQ 8000 Evo建立了藥物中三種常見雜質(zhì)（4-硝基卞醇、氨基乙腈鹽酸鹽及4-氯乙酰乙酸乙酯）的分析方法。以4-硝基卞醇為例，其是合成抗生素亞胺培南的主要原料。而4-硝基芐醇對眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚有刺激性，甚至部分毒理學(xué)數(shù)據(jù)表明其具有一定的致突變性。

【實驗結(jié)果/結(jié)論】

AutoSRM優(yōu)化方法

AutoSRM是賽默飛*的方法優(yōu)化功能。在進(jìn)行二級離子對優(yōu)化時，一般會涉及到多種儀器方法編輯（全掃描、子離子全掃描、選擇反應(yīng)監(jiān)測掃描）、進(jìn)樣序列編輯、離子與碰撞電壓的選擇。這個過程相當(dāng)繁瑣和復(fù)雜，如果不能實現(xiàn)自動化，實驗人員工作量會大大增加。AutoSRM功能將所有過程*實現(xiàn)自動化銜接，實驗人員無需編輯復(fù)雜的儀器方法和序列，只需在已給出的一級離子或二級離子中選擇合適的即可。甚至一針進(jìn)樣可以同時優(yōu)化10個不同碰撞電壓，大大提高實驗效率。一般來講，實驗人員只需對混標(biāo)進(jìn)樣三次，即可完成全部化合物的質(zhì)譜方法參數(shù)，包括離子對信息及碰撞能量的優(yōu)化。

圖1.前體離子優(yōu)化

圖2.子離子優(yōu)化

圖3.碰撞電壓優(yōu)化

結(jié)果

甲醇配制混標(biāo)，記為“母液”。4-硝基卞醇、4-氯乙酰乙酸乙酯及氨基乙腈鹽酸鹽濃度分別為2.56 ppm、10 ppm、3.75 ppm。甲醇稀釋母液，分別稀釋450倍（記為Std-1）及2500倍(記為Std-2)

表1.混標(biāo)濃度（µg/L）

表2.靈敏度實驗結(jié)果

圖4.混標(biāo)Std-2的色譜圖

非目標(biāo)物分析

氣質(zhì)進(jìn)行非目標(biāo)物分析時，往往是全掃描結(jié)合NIST等商業(yè)譜庫進(jìn)行。去卷積功能可以發(fā)現(xiàn)更多化合物，但從其中篩出特征性組分的難度隨著化合物數(shù)量的增加而顯著增加。Tracefinder工作站的unknown screening插件，在去卷積及譜庫檢索功能的基礎(chǔ)上可對樣品進(jìn)行差異分析。

采用分流進(jìn)樣，F(xiàn)ullscan全掃，分別采集儀器空白、溶劑空白以及不同樣品。利用該軟件進(jìn)行峰對齊并做熱圖分析。組分的響應(yīng)越大，熱圖顯示的顏色越深。而顏色相差越大代表該組分在不同樣品之間的差異也越大。也可將峰對齊結(jié)果直接導(dǎo)出，利用第三方統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)分析。由此，可快速找出樣品特征組分，大大提高了工作效率。

圖5.熱圖分析部分結(jié)果表

表3.部分化合物定性檢索結(jié)果

結(jié)論

三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀以出色的選擇性及高通量等特點，正逐步應(yīng)用于藥物中雜質(zhì)尤其是具有基因毒性的雜質(zhì)分析中。TSQ 8000 Evo具有業(yè)界高的靈敏度，其設(shè)計與推出旨在提高實驗室效率。*的AutoSRM功能，能夠快速優(yōu)化方法參數(shù)。Unknown Screening插件能夠在去卷積的基礎(chǔ)上執(zhí)行峰對齊及差異分析，可快速找出差異性或特征性組分。因此，TSQ 8000 Evo非常適合藥物中目標(biāo)物定量及非目標(biāo)物的定性分析。

【儀器/耗材清單】

質(zhì)譜儀：賽默飛TSQ 8000 Evo質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技，美國）；

氣相色譜儀：Trace 1310氣相色譜配AI 1310自動進(jìn)樣器（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：TG-WAX MS30 m*0.25 mm*0.25 µm毛細(xì)管色譜柱；

試劑：甲醇；