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特邀：華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院周婷課題組

課程組簡(jiǎn)介：周婷副教授于2012年入職華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域聚焦于手性藥物分析、手性藥物立體選擇性代謝及手性轉(zhuǎn)化研究、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、生物樣品前處理-色譜質(zhì)譜聯(lián)用等系統(tǒng)的研發(fā)。目前已在《Analytical Chemistry》，《Journal of Chromatography A》等雜志發(fā)表近40篇論文。

導(dǎo)讀

超臨界流體萃取-超臨界流體色譜（SFE-SFC）系統(tǒng)因使用二氧化碳（CO2）作為溶劑，具有價(jià)格低廉、無(wú)毒和臨界點(diǎn)易于實(shí)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)。但為了提高萃取效率，需要提高SFE的萃取溶劑強(qiáng)度，當(dāng)這些溶劑被轉(zhuǎn)移到SFC時(shí)，又會(huì)引起弱保留物質(zhì)的峰展寬。

為此，島津和華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院周婷老師課題組合作，創(chuàng)新性的開(kāi)發(fā)了變壓聚焦超臨界流體選擇性萃取色譜方法（PCF-SFSEC），該法擁有選擇性萃取、變壓聚焦兩大亮點(diǎn)，可以分析水性基質(zhì)，并且允許大體積進(jìn)樣分析，有效地解決了峰展寬和靈敏度損失的問(wèn)題。此外該方法不需要對(duì)儀器硬件部分進(jìn)行任何改造，可與三重四極桿和飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)于少量體積的復(fù)雜樣品中的痕量目標(biāo)物的在線分析。該結(jié)果發(fā)表在了分析化學(xué)領(lǐng)域影響力最高的期刊《Analytical Chemistry》上。

島津在線SFE-SFC聯(lián)用系統(tǒng)（Nexera UC系統(tǒng)）

摘要譯文：

樣品制備與色譜的在線耦合技術(shù)是分析化學(xué)中的前沿課題，因?yàn)樗钚』藰悠窊p失引起的誤差，縮短了分析時(shí)間，并減少了溶劑消耗。本研究開(kāi)發(fā)了一種在線壓力變化聚焦超臨界流體選擇性萃取色譜（PCF-SFSEC）技術(shù)，僅使用微升規(guī)模的樣品即可在一次運(yùn)行中實(shí)現(xiàn)萃取、純化、分離和檢測(cè)。壓力變化聚焦策略通過(guò)降低超臨界流體的溶解能力實(shí)現(xiàn)了柱頭堆疊，從而能夠?qū)⑤腿┐罅恳氤R界流體色譜，而不會(huì)導(dǎo)致峰展寬或失真。所有提取物都可以直接引入色譜系統(tǒng)，而無(wú)需分流。

基于超臨界流體選擇性萃?。?/span>SFSE）策略，吸附劑去除了樣品中的干擾和水分，有效地減輕了基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了直接水樣品分析。通過(guò)對(duì)大鼠血漿中22種手性藥物的對(duì)映選擇性分析，證明了在線PCF-SFSEC的有效性，這些藥物涵蓋了八類具有不同藥理作用的藥物。整個(gè)分析耗時(shí)25分鐘，僅消耗5μL樣品。PCF-SFSEC中的所有分析物都獲得了分辨率高于1.0的尖銳和對(duì)稱的峰，86%的分析物的分辨率高于1.5。定量限（LOQ）范圍為0.0600至32.1μg/L?；厥章试?5.8−117.2%的范圍內(nèi)。此外，與傳統(tǒng)方法相比，開(kāi)發(fā)的方法獲得了更令人滿意的重復(fù)性，并顯著降低了基質(zhì)效應(yīng)。新建立的在線PCF-SFSEC技術(shù)被認(rèn)為是復(fù)雜樣品手性分析的綠色和有力工具。

兩處創(chuàng)新 解決難題

變壓聚焦

在傳統(tǒng)的SFE-SFC中，由于萃取物的引入量過(guò)大，使用SFE-SFC分析弱保留分析物時(shí)，峰展寬和失真非常明顯，當(dāng)使用高比例強(qiáng)改性劑時(shí)，問(wèn)題更為嚴(yán)重。為了解決這個(gè)問(wèn)題，通常需要一種分流策略來(lái)減少引入SFC的萃取物量，但同時(shí)也導(dǎo)致樣品大量損失，從而降低了靈敏度和重復(fù)性。

PCF-SFSEC創(chuàng)新性地引入變壓聚焦（pressure change focusing, PCF）技術(shù)：因CO2的溶解能力與其密度成正比，密度受系統(tǒng)壓力的影響，因此通過(guò)調(diào)節(jié)CO2的壓力從而改變其溶解能力來(lái)實(shí)現(xiàn)分析物在柱頭的堆積。系統(tǒng)壓力越低，CO2的溶解力越弱，萃取物中的分析物在上樣過(guò)程中的擴(kuò)散急劇減少，反而聚焦在色譜柱頭，當(dāng)萃取物引入完成后，提高壓力重新形成超臨界流體CO2進(jìn)行高效分離，因此能夠獲得尖銳對(duì)稱的峰。此過(guò)程中無(wú)需分流，因此靈敏度和重復(fù)性得到保障。

應(yīng)用PCF技術(shù)（A）和傳統(tǒng)無(wú)PCF技術(shù)（B）的樣品裝載過(guò)程示意圖

選擇性萃取 

在分析復(fù)雜生物樣品時(shí)，SFE往往缺乏選擇性，因而基質(zhì)效應(yīng)比傳統(tǒng)液-液萃取方法更顯著，此外由于超臨界CO2與水之間的不兼容性，導(dǎo)致SFE無(wú)法直接分析水性樣品。受到分散固相萃取技術(shù)的啟發(fā)，我們?cè)谳腿」迌?nèi)引入吸附劑，用來(lái)吸附雜質(zhì)和脫水，有效地富集了分析物。

選擇性吸附示意圖

成果展示 多種手性藥物的分析

將開(kāi)發(fā)的PCF-SFSEC應(yīng)用于血漿中22種手性藥物的分析，并與傳統(tǒng)在線方法進(jìn)行比較，展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)：

優(yōu)勢(shì)一：顯著減少峰展寬

PCF-SFSEC有效減少了大量萃取劑導(dǎo)致的分析物在色譜柱中的擴(kuò)散現(xiàn)象，無(wú)需分流便可獲得清晰對(duì)稱的色譜峰，而在常規(guī)SFE-SFC中有50%的手性藥物表現(xiàn)出明顯的譜帶展寬，并且分離度與之相比也稍顯遜色。

在線PCF-SFSEC系統(tǒng)（A）和傳統(tǒng)在線SFE-SFC系統(tǒng)（B）目標(biāo)物色譜圖

優(yōu)勢(shì)二：基質(zhì)效應(yīng)明顯減少 

選擇AI2O3作為吸附劑，如圖所示，對(duì)于第一個(gè)洗脫的對(duì)映異構(gòu)體，22種手性藥物中有17種在PCF-SFSEC中的基質(zhì)效應(yīng)低于SFE-SFC。此外，在新系統(tǒng)下22種手性藥物中有18種表現(xiàn)出輕微的基質(zhì)效應(yīng)（-30至30%），3種手性藥物表現(xiàn)出中等基質(zhì)效應(yīng)（-60至-30%和30至60%），只有一種手性藥物表現(xiàn)出強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)（<-60%和>60%）。相比之下，13種手性藥物在在線SFE-SFC中具有中度和強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng)，這充分驗(yàn)證了PCF-SFSEC在去除干擾方面的有效性。

PCF-SFSEC（紅色）和傳統(tǒng)SFE-SFC（黑色）洗脫的第一個(gè)異構(gòu)體的基質(zhì)效應(yīng)

優(yōu)勢(shì)三：無(wú)需分流，顯著提高靈敏度

PCF策略允許將所有的萃取物引入色譜柱中分析，減少了樣品損失，使得靈敏度提高，那么效果如何呢？我們將本研究中的樣品消耗量與文獻(xiàn)中在線手性分離方法進(jìn)行了比較。如表1所示，PCF-SFSEC和以前的在線手性分離方法均獲得了µg/L水平的定量限，但相比之下，先前研究中使用的樣品量（20–100 µL）卻是本研究（5 µL）的4–20倍。

在線手性分離方法對(duì)比

專家心聲

華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，周婷副教授

華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院周婷副教授表示，島津的SFE-SFC系統(tǒng)（Nexera-UC）是一個(gè)強(qiáng)有力的分析工具。本文介紹的PCF-SFSEC技術(shù)正是基于該系統(tǒng)原有強(qiáng)大硬件和功能的基礎(chǔ)上，做方法設(shè)置上的創(chuàng)新優(yōu)化，最后得到的結(jié)果優(yōu)異，并發(fā)表在《Analytical Chemistry》上，證明Nexera-UC系統(tǒng)結(jié)合PCF-SFSEC技術(shù)，開(kāi)拓了SFC領(lǐng)域的又一較大的發(fā)展空間，具有廣泛的應(yīng)用前景。

撰稿人：鐘啟升

參考文獻(xiàn)：Jieqing Feng, etc., Anal. Chem. 2022, 94(46), 16222-16230.

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